树突状细胞负载肺癌细胞抗原的方法研究

　　　　 作者：王勇， 张 科， 童继春， 钱科卿， 史央， 陆俊欢， 时宏珍

【摘要】 目的: 建立自体热休克凋亡肺癌细胞抗原制备、 树突状细胞（DC）体外诱导、 以及抗原负载方法， 为制备DC肿瘤疫苗提供技术基础。方法: 采用酶消化法从手术切除的肺癌新鲜组织获得单细胞悬液， 热休克后用白桦脂酸诱导其凋亡制备成细胞抗原; 采用血细胞分离机采集外周血单个核细胞（PBMC）， 贴壁法获得单核细胞， 经GMCSF与IL4体外诱导成未成熟树突状细胞（imDC）; 负载细胞抗原后制备成DC肿瘤疫苗， 并对DC疫苗的形态、 数量及表型特征进行分析。结果: （1）肿瘤细胞抗原得率: （13.68±1.30）×106/g组织; 平均凋亡率: （93.79±2.31）%; （2）imDC平均得率为（9.37±0.83）×106/（118.77±12.56）×106个PBMC， 活率&>95%; imDC表型分析: CD11c+CD14-、 CD11c+HLADR+、 CD11c+CD80+、 CD11c+CD83+、 CD11c+CD86+ 表达率分别为（87.45±3.42）%、 （87.16±1.08）%、 （2.80±1.52）%、 （5.64±1.56）%、 （5.11±1.09）%; （3）DC疫苗平均得率为（5.75±0.69）×106/（9.37±0.83）×106个imDC， 活率&>95%， DC疫苗表型: CD11c+CD14-、 CD11c+HLADR+、 CD11c+CD80+、 CD11c+CD83+、 CD11c+CD86+ 表达率分别为（92.73±1.21）%、 （89.35±2.31）%、 （86.80±1.23）%、 （69.53±7.21）%、 （94.92±1.48）%。 结论: 该方法稳定、 安全、 可靠， 可制备出具有成熟DC表型的肿瘤疫苗。

【关键词】 树突状细胞; 肺癌; 疫苗

　　树突状细胞（dendritic cell， DC）是至今发现的体内功能最强的抗原提呈细胞（antigen presenting cells， APC）， 具有激活静息性T淋巴细胞成为抗原特异性细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes， CTL）的特殊功能， 在机体抵抗肿瘤发生、 发展中发挥关键作用［1， 2］。同时DC还能与其他免疫细胞如自然杀伤细胞(natural killer cell， NK)、 NKT细胞发生相互作用， 分泌细胞因子增强机体的天然免疫功能［3， 4］。

　　近年来， DC疫苗在肿瘤临床综合治疗中的作用与应用已引起广泛重视， 成为肿瘤生物治疗的重要代表。以患者自体肿瘤细胞作为抗原负载自体DC而制备DC疫苗在国外已有研究［5， 6］， 但国内尚未见相关报道。本研究将探讨并建立利用肺癌细胞抗原负载自体DC的实验方法， 为今后肺癌DC疫苗的研制提供依据， 为肺癌的生物治疗提供手段。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 RPMI1640培养基购自JRH公司。人重组GMCSF与IL4购自R&&D公司。AB血清购自常州市中心血站。淋巴细胞分离液购自上海恒信化学试剂有限公司。PE标记的小鼠抗人CD80、 PE标记的小鼠抗人CD83、 PE标记的小鼠抗人CD86、 PerCP标记的小鼠抗人HLADR、 APC标记的小鼠抗人CD11c、 PE标记的小鼠抗人CD14单克隆抗体（mAb）购自BD公司。内毒素检测试剂盒购自湛江安度斯生物有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 肺癌单细胞悬液制备 于手术过程中， 无菌采集新鲜肺癌肿瘤组织3～5 g左右， 迅速放入装有无菌组织保存液的运输瓶中， 用封口膜封口， 置于4℃冰上运输至实验室。组织称重后， 用含双抗的生理盐水洗涤数次， 剔除结缔组织、 脂肪及坏死组织。将肺癌组织剪碎至1～2 mm3大小， 加入胶原酶， 37℃培养箱作用30～50 min， 将消化后的细胞悬液过筛（200目）， 收集单细胞悬液。苔盼蓝染色法对细胞进行计数， 并计算活细胞比例。

　　1.2.2 凋亡细胞抗原制备 用RPMI1640培养液调整细胞密度至1×109/L， 将细胞置于40℃、 50 mL/L CO2培养箱中3 h， 取出细胞培养瓶， 加入白桦酯酸至终浓度为10 mg/L， 将细胞培养瓶移至37℃、 50 mL/L CO2培养箱继续培养诱导细胞凋亡。收获凋亡细胞， 加入无菌PBS洗涤4次， 获得凋亡肿瘤细胞抗原［7］。

　　1.2.3 抗原质量检测 用苔盼蓝染色法进行计数与活细胞鉴别。用FITCAnnexinV和PI标记细胞， 进行流式检测［8］， 计算细胞凋亡率。软琼脂克隆法［9］检测细胞抗原体外成瘤能力。内毒素检测按《中华人民共和国药典》2005版第3部规定的方法进行。

　　1.2.4 制备DC （1）PBMC采集: 采用血细胞分离机进行PBMC的采集。按仪器说明书和相关临床操作规程进行。将浓缩白细胞用生理盐水洗涤1次获得新鲜的PBMC。（2）DC诱导: 用RPMI1640 培养液重悬新鲜制备的PBMC后铺于6孔细胞培养板中， 放置于37℃， 50 mL/L CO2培养箱中90 min后， 洗去未贴壁细胞， 于培养板内加入含100 μg/L GMCSF， 50 μg/L IL4的RPMI1640完全培养液， 第3天进行换液， 第5天收获imDC， 苔盼蓝染色进行细胞计数， 部分细胞作于抗原负载， 部分用于细胞表型检测。

　　1.2.5 抗原负载DC 用RPMI1640 完全培养液重悬imDC， 加入凋亡肿瘤细胞抗原（DC∶细胞抗原=3∶1）， 至37℃， 50 mL/L CO2培养箱共同培育48 h， 收获DC细胞， 苔盼蓝染色进行细胞计数与表型检测。

　　1.2.6 DC表型检测 流式检测方法参照文献方法进行［10］。用CD11cAPC、 CD14PE、 HLADRPerCP、 CD80PE、 CD83PE和CD86PE分别标记imDC和DC， 流式细胞仪（FACSCallbur， BD公司）检测， 应用CellQuest软件进行分析。

　　2 结果

　　2.1 肺癌细胞抗原制备 5例肺癌患者（4例腺癌， 1例鳞癌）的自体肿瘤组织制备得到的单细胞数量平均为（55.24±4.89）×106， 平均得率为（13.68±1.30）×106/g组织， 细胞活率为（86.07±6.02）%; 凋亡后， 抗原得率为（91.07±3.84）%， 凋亡率为（93.79±2.31）%， 细胞抗原体外成瘤试验均为阴性， 内毒素检测均合格（表1）。图1示2例患者的凋亡细胞流式细胞图， 图a为阴性对照， 图b为诱导凋亡24 h， 图c为诱导凋亡48 h， 图d为诱导凋亡72 h的流式图。表1 肺癌组织单细胞悬液制备结果

　　2.2 imDC得率及表型分析 收集诱导5 d的悬浮细胞， 即为imDC， 苔盼蓝染色计数， 5例患者的平均数量为（9.37±0.83）×106/（118.77±12.56）×106个PBMC， 细胞活率均&>95%。经流式细胞术分析显示， 5例患者的imDC中， CD11c+CD14-细胞为（87.45±3.42）%， CD11c+HLADR+细胞为（87.16±1.08）%， CD11c+HLADR+细胞中， CD80+细胞为（2.80±1.52）%， CD83+细胞为（5.64±1.56）%， CD86+细胞为（5.11±1.09）%（图2）。

　　2.3 抗原负载的DC得率及表型分析 抗原负载imDC 48 h后， 细胞多呈树枝状不规则变化， 贴壁， 收获细胞， 即为DC疫苗， 苔盼蓝染色计数， 5例患者的平均数量为（5.75±0.69）×106/（9.37±0.83）×106个imDC， 细胞活率&>95%。经流式细胞术分析显示， CD80+、 CD83+、 CD86+细胞比率较imDC有明显升高， 呈现典型的成熟DC表型。5例患者的DC疫苗中， CD11c+CD14-细胞为（92.73±1.21）%， CD11c+HLADR+细胞为（89.35±2.31）%， CD11c+HLADR+细胞中， CD80+细胞占（86.80±1.23）%， CD83+细胞占（69.53±7.21）%， CD86+细胞占（94.92±1.48）%， 内毒素检测均合格（表2）。图3 示抗原负载前后显微镜下DC形态图（吉姆萨染色）。

　　3 讨论

　　肿瘤抗原的抗原性与免疫原性是影响DC疫苗的重要参数， 采用患者自体肿瘤组织制备的抗原携带了肿瘤细胞的全部抗原信息， 且来源于患者自身， 安全方便， 3～5 g肿瘤组织制备的抗原量即能满足DC疫苗的制备需要。

　　热休克可以使肿瘤细胞高表达热休克蛋白（Hsp）， DC表面表达多种HSP受体（如CD91， CD40， TLR2/4或LOX1）， 通过受体介导的内吞机制将能使DC高效地摄取Hsp多肽复合物抗原， 用富含Hsp的肿瘤细胞负载DC可提升DC负载的效率［7］。我们采用先将肿瘤细胞处于热休克状态， 诱导细胞高表达Hsp， 再用化学药物诱导细胞凋亡进而制备成富含Hsp的凋亡细胞抗原。

　　DC的体外培养在目前已经是一项比较成熟的技术。本研究采用血细胞分离机单采患者PBMC作为DC培养的来源， 取材方便， 制备过程简单， 适合临床应用。通过GMCSF和IL4培养5 d后， 加入患者自体肿瘤组织制备的抗原刺激DC成熟。经流式细胞术检测， DC疫苗具有成熟DC的表型特征， 高表达CD80、 CD83、 CD86。文献表明， DC的成熟状态和其诱导的免疫反应的类型和程度有密切关系。成熟DC启动免疫应答， 而不成熟的DC参与免疫耐受［11］， 在本研究中， 采用自体肿瘤组织负载制备得到的DC疫苗成熟度较高， 可用于诱导抗肿瘤免疫。

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