聚乙二醇修饰鼠抗人CD3单克隆抗体

　　　　 作者：马杭圣， 王 鸿， 孙汉栋， 易喻， 应国清

【摘要】 目的: 确定一条聚乙二醇化鼠抗人CD3单克隆抗体（mAb）和抗体片段的制备工艺路线。方法: 以胃蛋白酶酶解并通过凝胶柱分离和纯化得到抗体Fab′， 利用PEGSPA修饰抗体和抗体片段Fab′上的氨基， 通过体内和体外T细胞增殖实验， 考查修饰后的抗体和抗体片段的免疫活性。结果: 较佳的修饰工艺条件为: 在pH9.0硼酸缓冲液， 反应温度25℃， 抗体浓度0.2 g/L， 抗体和聚乙二醇摩尔比为1∶20， 反应3 h。修饰后抗CD3 mAb全抗， 对T淋巴细胞增殖抑制活性下降了32.3%， 抗体Fab′下降了8.0%， PEG化Fab′下降了19.9%。利用ELISA检测血液中修饰后的抗体和抗体片段的半衰期。结果显示mPEG修饰后抗体和抗体片段血药浓度降低明显减缓， 修饰后抗CD3抗体半衰期从2.66 h延长到8.72 h， 延长了3.28倍。而修饰后抗体Fab′片段半衰期从2.21 h延长到4.17 h， 延长了1.90倍。结论: 利用聚乙二醇修饰抗体和抗体片段， 提高了抗体半衰期， 且无细胞毒性， 活性损失较小， 该技术具有较高的可行性， 可极大地提高mAb尤其是非人源性抗体在临床上的应用。

【关键词】 单克隆抗体; CD3; 聚乙二醇; 化学修饰; 免疫活性

　　鼠抗人抗CD3 单克隆抗体（mAb）因具有毒副作用少、 使用剂量低、 半衰期长等优点， 而在器官移植领域中得到了广泛的应用。但鼠抗人抗CD3 mAb也存在很多缺点， 最主要的是该抗体是鼠源性， 器官移植患者单独使用该抗体治疗后5～7 d ， 机体产生严重的特异性体液免疫反应， 导致其被快速清除， 半衰期明显缩短， 限制了其治疗效果。目前国内外普遍采用聚乙二醇(PEG)化学修饰［1］来起到药物毒副作用减少、 半衰期延长、 免疫源性降低的目的［2， 3］， 并且修饰后的药物也被各国药监部门认可， 并批准上市。我们利用胃蛋白酶酶解抗体制备抗体Fab′， 并对PEG修饰鼠抗人抗CD3 mAb和Fab′片段的反应条件进行优化， 探讨了各因素对修饰度大小影响， 再对获得的PEG化抗体及Fab′片段的体内体外生物活性功能进行了初步研究。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 清洁级ICR雄性小鼠20 g购于浙江省医药科技学院， 鼠抗人CD3 mAb购于北京天广实生物技术有限公司， 牛血清白蛋白(BSA)， Sephadex G75， sephadex G25， TNBS， 碘乙酰胺等购于Sigma公司， PEG5000SPA购于北京凯正生物技术有限公司， β巯基乙醇购于博大泰克公司， 辣根过氧化酶标记的羊抗小鼠IgG抗体购自北京博奥森生物技术有限公司， 无血清RPMI1640培养液、 噻唑兰(MTT)、 伴刀豆球蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 抗CD3mAb的纯化 取鼠抗人CD3mAb， 置于截留相对分子质量（Mr）为100 000的Amicom 30超滤膜离心管(美国Amicom 公司产品)超滤分离， 4 500 r/min， 15 min离心浓缩除去牛血清白蛋白， 加入0.1 mol/L pH7.4 PBS稀释， 计算IgG回收率。

　　1.2.2 抗CD3mAb F(ab′)2 及Fab′片段的制备和纯化 利用胃蛋白酶分解IgG， 将抗体断链为Fab′和Fc片段［4］。即取结晶胃蛋白酶3 mg， 溶于0.1 mol/L pH4.0醋酸缓冲液500 mL中， 取抗CD3 mAb (1 g/L)100 μL， 加入1 mL上述溶液中。于30℃作用16 h。置于截留Mr为50 000的Amicom 30超滤膜离心管(美国Amicom 公司产品)， 4 500 r/min， 15 min离心浓缩， 加入0.1 mol/L pH7.4 PBS缓冲液过夜。以上清过Sephadex G75(40 cm×1.0 cm)以0.1 mol/L PBS缓冲液洗脱， 得抗CD3 mAb F(ab′)2片段。将上述收集液， 加入硫醇使成0.1 mol/L， 在室温下搅拌30 min。加入1 mol/L的碘乙酰胺（Indoacetamide）使成为0.1 mol/L， 室温下搅拌1 h。置于截留Mr为30 000的Amicom 30超滤膜离心管(美国Amicom 公司产品) ， 4 500 r/ min， 15 min离心浓缩， 加入0.1 mol/L pH7.4 PBS过夜。以上清过SephadexG75(40 cm×1.0 cm)收集。得抗CD3 mAb Fab′片段。分别测A280和A260值， 计算蛋白质质量浓度(g/L)＝1.45（A280）-0.74（A260）， 并计算回收率。

　　1.2.3 PEG化抗CD3mAb和抗体片段的制备 取适量PEG5000SPA加入鼠抗人CD3 mAb和抗体片段［5， 6］， 在不同的条件下进行反应， 过排阻柱分离纯化。平均氨基修饰度测定采用TNBS法对修饰抗体进行平均氨基修饰度测定。氨基修饰率= 1-氨基残留率(%) 。表1 L9（34）试验因素水平

　　1.2.4 PEG化抗CD3mAb和抗体片段的体外免疫活性和细胞毒性检测 MTT法测定: 取常规制备小鼠脾细胞悬液， 用无血清RPMI1640 培养液调整细胞密度为1×1010/L， 加于96 孔培养板每孔加板50 μL， 前4排不加刺激源， 后8排分别加入ConA和LPS（刺激T细胞和B细胞的增殖）， 再将PEG化抗CD3 mAb和抗体片段以原浓度为0.2 g/L， 以不同浓度加入37℃、 50 mL/L CO2培养44 h， 各孔加入MTT（2 g/L， PBS溶解）50 μL/孔， 继续培养4 h。1 800 r/min离心5 min， 弃去各孔内液体， 加含2%～4% 1 mol/L盐酸的DMSO溶液150 μL/孔， 置暗处室温震荡15～30 min， 酶标仪492 nm处测A值。计算SI公式为: SI=（A刺激孔-A本底）/（A正常孔-A本底）。

　　1.2.5 PEG化抗CD3mAb和抗体片段的体内免疫活性的检测 迟发性超敏反应测定: 取65只清洁级ICR小鼠(♀18～20 g)， 分成13组， 用硫化钠腹部脱毛， 将新配制的DNFB丙酮麻油溶液50 μL均匀涂抹腹部脱毛处致敏。致敏当天， 致立即腹腔注射(ip)， 其中1组注射生理盐水， 另外12组每组分别注射不同药物3个剂量(高、 中、 低分别为0.2、 0.04、 0.008 g/L， 以0.1 mL/10 g体质量注射， 隔天注射。致敏第5天， 用新配制的DNFB丙酮麻油溶液10 μL 均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击。攻击后 24 h 颈椎脱臼处死小鼠， 剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8 mm的耳片， 称质量。

　　1.2.6 PEG化抗CD3mAb和抗体片段的体内半衰期的检测 取家兔4只（1～2 kg）， 分别静脉注射(iv)不同的药物0.1 mg/kg， 2 mL， 分别于0、 0.5、 1、 2、 4、 8、 12、 24、 48 h取血1 mL， 将血样离心30 min 后分离血清， -20℃保存待测。ELISA法测定: 待测血清用PBS稀释成1∶125， 1∶250， 1∶500， 1∶1 000， 1∶2 000， 1∶4 000加到96孔培养板， 每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1 mL。用0.05 mol/L pH9.6碳酸盐包被缓冲液将待测血清进行包被。4℃过夜(同时做空白孔， 阴性对照孔及阳性对照孔)。次日， 弃去孔内溶液， 用PBSTween20 (PBST)缓冲液洗涤3次， 每次3 min。加10 g/L BSA 0.1 mL于上述已包被反应孔中， 置37℃孵育1 h。然后洗涤。于各反应孔中， 加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度为1∶5 000) 0.1 mL。37℃孵育0.5～1 h， 洗涤。于各反应孔中加入临时配制的OPD底物溶液0.1 mL， 37℃避光反应10～30 min， 加入2 mol/L硫酸0.05 mL终止反应， 在酶标仪上测定495 nm吸光值。血药浓度进行药物动力学分析。

　　2 结果

　　2.1 抗CD3mAb的纯化 利用考马氏亮蓝法， 测定超滤膜分离前后的蛋白质浓度， IgG回收率为84.03%。

　　2.2 抗CD3mAb Fab′片段的制备和纯化 经葡聚糖G75凝胶柱排阻分离后， 有明显的二个峰， 第1个峰为双硫键未被打断的抗CD3mAb F(ab′)2， 第2个峰为本实验所要获得的Fab′片段峰（图1）。收集第10～16管过滤液， 超滤浓缩， 利用吸收差公式得到: 抗体片段Fab′蛋白质质量浓度（g /L）＝1.45×0.582-0.74×0.266＝0.647 g/L。抗体片段Fab′回收率=0.647/1.0×100%=64.7%。未被酶解的抗CD3 mAb（1列）Mr在200 000以上， 155 000附近出现了蛋白带（200 000以上的条带应该是抗体的多聚物， 155 000为抗体Mr）， 而酶解后的抗CD3mAb F(ab′)2片段（2列）Mr在155 000以上， 110 000附近出现了蛋白带， 酶解后的抗CD3mAb Fab′片段（3列）Mr则在55 000附近出现了蛋白带， 并且只出现单一条带（图2）。因此可以判定利用胃蛋白酶酶解并用β﹣巯基乙醇还原可得到较大分子的Fab′片段和小分子多肽碎片(PFc′)， 通过超滤膜分离和凝胶排阻层析， 除去了小分子多肽碎片， 获得Fab′片段， 纯度已较高且基本无杂多肽碎片。

　　2.3 PEG修饰条件的优化 根据正交实验数据处理方法， 得出抗体浓度和PEG与抗体摩尔比对反应的影响最大， 且随着蛋白浓度和抗体摩尔比的增加， 修饰率越高。pH值其次， 温度影响较小（表2）。但修饰率达到60％左右就不再升高， 可能是因为空间位阻的影响。因修饰是一复杂反应， 要想获得单修饰的产品， 必须选择温和的反应条件， 且考虑成本问题。确定PEG化鼠抗人CD3mAb的最佳工艺条件为pH9.0 ， 反应温度25℃， 抗体质量浓度0.2 g/L， 抗体和PEG摩尔比为1∶20。

　　2.4 PEG化抗CD3mAb和抗体片段的体外免疫活性及细胞毒性检测 通过体外淋巴增殖实验， 考察PEG化抗CD3 mAb和Fab′体外免疫活性和细胞毒性， 结果表明， 经PEG修饰的抗CD3 mAb全抗， 对T淋巴细胞增殖抑制活性下降了32.28%， 抗体Fab′下降了7.96%， PEG化Fab′下降了19.92%。且只对T淋巴细胞增殖有特异性的抑制， 对B淋巴细胞增殖没有抑制作用(表3、 4)。抗体、 Fab′片段和其PEG修饰物都基本无细胞毒性。表2 正交验证试验结果表3 体外T淋巴增殖实验表4 体外B淋巴增殖实验

　　2.5 mPEG 化抗CD3mAb和抗体片段体内免疫活性 抗CD3 mAb能显著地免疫抑制小鼠的DTH 反应。修饰和未修饰抗体和抗体片段的3个剂量均能显著地下调小鼠左右耳片重量的差值(P&<0.01) ， 其作用随给药剂量的增加明显的变化。其中以2 mg/(kg·d) 最为显著， 0.08 mg/(kg·d) 剂量组则对小鼠左右耳片差值的下调作用已不太明显。活性损失与体外实验结果基本一致（表5）。

　　2.6 PEG化抗CD3mAb及抗体片段的体内半衰期 经过mPEG5000修饰后mAb在体内代谢明显延长， 未修饰抗体静脉注射半小时左右， 血液中抗体几及可达到峰值， 随后血药浓度很快降低， 4 h内已减少至峰值的40%左右。而修饰后抗体， 峰值出现在1 h左右， 且血药浓度降低明显减慢。4 h时血药浓度还保持在峰值的80%左右， 修饰前后半衰期从2.66 h延长到8.72 h， 延长了3.28倍（图3）。

　　而抗体Fab′片段由于Mr较小， 故体内代谢时间较全抗明显缩短。修饰前Fab′体内代谢极快， 2 h左右已减少至峰值的50%。而修饰后Fab′ 2 h时血药浓度还有峰值的68%， 修饰前后半衰期从2.21 h延长到4.17 h， 延长了1.90倍（图4）。 表5 抗体对小鼠DTH反应的影响

　　3 讨论

　　抗CD3 mAb主要针对T细胞表面的标记性CD3分子， 激发或阻断T细胞活化信号转导， 清除效应T细胞或诱导调节T细胞产生， 使细胞毒性T细胞不能发挥其杀伤靶细胞的功能， 故抗CD3 mAb只能造成活化的成熟T 细胞发生凋亡， 对处于B淋巴细胞则无此作用。而本实验也显示抗CD3 mAb只对T淋巴细胞增殖有特异性的抑制， 对B淋巴细胞增殖没有抑制作用， 与Wesselborg等人的发现基本符合。

　　目前很多研究都是针对鼠源性抗体进行基因构建， 制备基因工程抗体， 但对抗体的基因工程改造， 不可避免的导致抗体与抗原的结合能力的大幅降低， 且容易带来细胞毒性。而聚乙二醇化学修饰即避免了基因构建的繁琐过程， 又可以起到毒副作用减少、 半衰期延长、 免疫原性降低的目的。陈金武等利用聚乙二醇修饰重组人生长激素， 结果mPEG修饰后， 明显降低了rhGH的抗体滴度， 缩短了抗体持续时间。在药动学研究中发现， 其t1/2从3.1 h显著延长到PGH1的9.9 h和PGh3的22.5 h。Hurwitz等利用聚乙二醇修饰抗ErbB2抗体， 结果发现不同Mr和不同修饰位点修饰后， 抗体免疫活性都有所降低， 但半衰期明显延长。

　　本实验研究利用无免疫原性的MPEG化学修饰鼠抗人抗CD3 mAb和其抗体片段上的氨基基团， 从而将PEG分子耦联到抗体分子上， 通过正交实验确定最佳修饰工艺路线， 得到较高修饰率的PEG化抗体和抗体片段， 并对其生物学活性以及体内半衰期进行了初步的检测。结果表明， 经PEG修饰的抗CD3 mAb， 对T淋巴细胞增殖抑制活性下降了32.28%， 抗体Fab′下降了7.96%， PEG化Fab′下降了19.92%。但mPEG修饰后mAb和抗体片段血药浓度降低明显减缓， 修饰后抗CD3 mAb半衰期从2.66 h延长到8.72 h， 延长了3.28倍。而修饰后抗体Fab′片段半衰期从2.21 h延长到4.17 h， 延长了1.90倍。

　　由此可认为， 利用们聚乙二醇修饰抗体， 降低抗体本身的免疫原性， 延长其半衰期这一方法， 具有较高的可行性， 且可极大的提高mAb尤其是非人源性抗体在临床上的应用， 为进一步规模化应用提供了实验依据。

参考文献

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