培养前后脐血CD34+细胞在NOD/SCID鼠体内造血重建功能的比较

　　　　 作者：杨施， 蔡海波， 金慧丽， 谭文松

【摘要】 目的: 以NOD/SCID小鼠为模型， 经半致死剂量照射后输注新鲜或培养后的造血细胞， 以比较培养前后脐血CD34+细胞的造血重建功能。方法: 从新鲜脐血中分离单个核细胞（MNC）， 采用干细胞因子（SCF）、 血小板生成素（TPO）、 Flt3配体（FL）、 白细胞介素3（IL3）和白细胞介素6（IL6）细胞因子组合体外培养14 d。通过MiniMACS免疫磁性吸附柱从新鲜或培养后的MNC中分离CD34+细胞， 4×105个CD34+细胞和5×106CD34-细胞混合后通过尾静脉输注入NOD/SCID小鼠中。饲养过程中动态观察外周血象恢复情况， 6周后检测小鼠骨髓和脾脏细胞中人源细胞及各系造血细胞的含量。结果: 体外培养MNC 14 d后， 总细胞扩增了1.78倍; 细胞移植6周后， 输注新鲜和培养后造血细胞的小鼠均存活， 在小鼠骨髓和脾脏中均可检测到人源细胞及各系人源血细胞和人特异ALU基因序列， 小鼠外周血象恢复到辐照前水平。培养后CD34+细胞在小鼠体内的植入水平与新鲜CD34+细胞的相近， 而其各系人源血细胞的含量高于新鲜CD34+细胞。 结论: 体外培养14 d后的CD34+细胞仍保持了体内植入和重建造血的能力， 且其多系造血重建能力优于新鲜CD34+细胞。

【关键词】 CD34+细胞; 造血重建; NOD/SCID小鼠

　　［Abstract］ AIM: To study the hematopoietic reconstitution ability of fresh and cultured cord blood CD34+ cells by sublethally irradiated NOD/SCID mice. METHODS: Mononuclear cells (MNC) were separated from cord blood and then cultured with stem cell factor (SCF)+ flt3 ligand (FL)+thrombopoietin (TPO)+ interleukin3 (IL3)+ IL6 for 14 d. CD34+ cells were isolated from fresh or cultured MNC using miniMACS magnetic separation system. Then 4×105 CD34+ cells together with 5×106 CD34- cells were injected into NOD/SCID mice. After transplantation， the dynamics of hematopoieitc recovery in the mice were measured. After 6 weeks， bone marrow (BM) and spleen samples were obtained from mice for detecting human cells. RESULTS: The number of total cells increased 1.78fold after 14 d of culture. All recipients received fresh and cultured CD34+ cells survived. Human cells， human lineage cells and human ALU sequence could be detected in BM and spleen. The peripheral blood counts of all transplanted mice recovered. The engraftment levels of cultured CD34+ cells were similar to those of fresh CD34+cells but the percentage of human lineage cells was higher than that of fresh CD34+ cells. CONCLUSION: CD34+ cells cultured for 14 d still preserved the hematopoietic reconstitution ability and showed better multilineage reconstitution ability than fresh CD34+ cells.

　　［Keywords］CD34+ cells;　　hematopoietic reconstitution; NOD/SCID mice

　　［摘 要］ 目的: 以NOD/SCID小鼠为模型， 经半致死剂量照射后输注新鲜或培养后的造血细胞， 以比较培养前后脐血CD34+细胞的造血重建功能。方法: 从新鲜脐血中分离单个核细胞（MNC）， 采用干细胞因子（SCF）、 血小板生成素（TPO）、 Flt3配体（FL）、 白细胞介素3（IL3）和白细胞介素6（IL6）细胞因子组合体外培养14 d。通过MiniMACS免疫磁性吸附柱从新鲜或培养后的MNC中分离CD34+细胞， 4×105个CD34+细胞和5×106CD34-细胞混合后通过尾静脉输注入NOD/SCID小鼠中。饲养过程中动态观察外周血象恢复情况， 6周后检测小鼠骨髓和脾脏细胞中人源细胞及各系造血细胞的含量。结果: 体外培养MNC 14 d后， 总细胞扩增了1.78倍; 细胞移植6周后， 输注新鲜和培养后造血细胞的小鼠均存活， 在小鼠骨髓和脾脏中均可检测到人源细胞及各系人源血细胞和人特异ALU基因序列， 小鼠外周血象恢复到辐照前水平。培养后CD34+细胞在小鼠体内的植入水平与新鲜CD34+细胞的相近， 而其各系人源血细胞的含量高于新鲜CD34+细胞。 结论: 体外培养14 d后的CD34+细胞仍保持了体内植入和重建造血的能力， 且其多系造血重建能力优于新鲜CD34+细胞。

　　［关键词］CD34+细胞; 造血重建; NOD/SCID小鼠

　　脐血作为一种造血干/祖细胞的来源具备采集方便、 GVHD发生率低等许多优势， 但是由于单份脐血所含的造血干/祖细胞的绝对数量有限， 限制了其在临床上的应用， 采用体外扩增技术可以解决这一瓶颈［1］。然而， 对体外扩增后的造血干/祖细胞能否保持其生理功能还存在许多争议。Astori等［2］采用Dideco “Pluricell System”扩增脐血CD34+细胞， 发现其在NOD/SCID小鼠体内的植入水平明显高于新鲜脐血CD34+细胞。而Xu等［3］却报道， 经SCF、 IL6、 FL和巨核细胞生长发育因子(megakaryocyte growth and development factor， MGDF)培养14 d的脐血CD34+细胞， 其植入水平明显低于新鲜CD34+细胞。NOD/SCID小鼠是一种先天免疫缺陷的动物模型， 能够支持异基因造血干/祖细胞的植入和生长， 被广泛应用于造血干/祖细胞的研究中。我们以NOD/SCID小鼠作为移植模型， 比较培养前后的CD34+细胞的造血重建功能， 为扩增后脐血造血干/祖细胞应用于临床提供了有益试验结果。1 材料和方法

　　1.1 材料 实验小鼠采用6～8周龄NOD/SCID小鼠， 由中国科学院上海实验动物中心提供; 脐血由上海国际和平妇幼保健院提供; 淋巴细胞分离液为上海华精公司产品; MiniMACS免疫磁性吸附柱分离装置和CD34+细胞选择试剂盒均购自德国Miltenyi Biotec GmbH公司; 体外培养基本培养基IMDM购自Gibco公司， 胎牛血清为美国Hyclone公司产品， 2巯基乙醇为Sigma公司产品; 所有细胞因子均购自美国Peprotech公司; 流式检测中所用抗体均为法国Immunotech产品; 流式细胞分析仪(FACS Caibur)购自BD公司; 基因组DNA提取试剂盒购自天根公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 脐血单个核细胞（MNC）的分离 脐血经淋巴细胞分离液密度梯度离心后， 收集MNC， 洗涤2次后备用。新鲜分离和培养14 d的MNC， 采用MiniMACS免疫磁性吸附柱分离装置， 按照CD34+细胞选择试剂盒说明书进行操作即获得纯化的CD34+细胞。

　　1.2.2 脐血单个核细胞体外培养 体外培养基采用IMDM， 使用时添加200 mL/L胎牛血清和5×10-5 mol/L 2巯基乙醇。采用细胞因子组合为SCF+FL+TPO+IL6+IL3， 其浓度分别为50、 50、 20、 20和5 μg/L。MNC以1×109/L的密度接种于24孔板， 每孔培养体积为2 mL， 每周半量稀释换液2次。细胞培养在37℃、 体积分数为50 mL/L CO2及饱和湿度的培养箱中进行。培养14 d后收获细胞， 分离CD34+和CD34-细胞。

　　1.2.3 细胞计数 总细胞采用血球计数板计数。检测总细胞中CD34+细胞百分含量时， 用PE标记的小鼠抗人CD34抗体标记总细胞， 用流式细胞术分析。CD34+细胞的绝对数量采用如下公式: CD34+细胞的绝对数量＝总细胞个数×CD34+细胞百分含量。

　　1.2.4 小鼠移植实验 细胞移植前， 对小鼠进行2.7 Gy亚致死剂量的137Cs射线照射。实验小鼠共分3组: (1)对照组: 不输注任何细胞; (2)未培养细胞组: 输注4×105个新鲜CD34+细胞和5×106CD34-细胞; (3)培养后细胞组: 输注4×105个培养14 d的CD34+细胞和5×106个CD34-细胞。移植时， 将待输入CD34+细胞和CD34-细胞混合后悬浮于0.3 mL的IMDM中， 经尾静脉注射输入小鼠体内。饲养6周后， 将小鼠颈脱臼处死， 获取骨髓和脾脏细胞进行人源细胞含量分析。

　　1.2.5 小鼠外周血象分析和细胞表型分析 小鼠外周血采集分别在移植前、 移植后第7天、 28天和第42天进行， 每次由眼眶采血50 μL， 进行外周血象分析。标抗体前， 先裂解红细胞， 然后用FITC标记的小鼠抗人CD45抗体、 PE标记的小鼠抗人CD3抗体、 小鼠抗人CD19抗体、 小鼠抗人CD33抗体、 小鼠抗人CD34抗体和小鼠抗人CD71抗体标记细胞以分析以人源各系细胞的含量。标好抗体的细胞4℃孵育30 min之后用PBS洗2遍， 离心后， 每管加0.5 mL 抗体保存液。标记细胞用流式细胞术分析， 结果用CellQuest软件处理。

　　1.2.6 人源ALU序列检测 抽提小鼠骨髓和脾脏细胞中的DNA， 提取时按照基因组DNA提取试剂盒进行操作。阴性对照为NOD/SCID小鼠细胞基因组DNA， 阳性对照为人外周血白细胞基因组DNA， 实验组分别为未培养细胞组和培养后细胞组小鼠骨髓和脾脏细胞基因组DNA。ALU序列引物正义链为5′CACCTGTAATCCCAGCAGTTT3′， 反义链为5′CGC GATCTCGGCTCACTGCA3′， 扩增片段长221 bp。反应参数为: 94℃预热4 min， 94℃变性1 min， 55℃退火45 s， 72℃延伸1 min， 共21个循环， 72℃补齐延伸5 min， 扩增片段长为221 bp， PCR产物用20 g/L的琼脂糖分离， 用溴化乙锭染色后观察。

　　1.2.7 统计学分析 实验数据以x±s表示， 采用SPSS统计软件作Student’s t检验， P&<0.05表示有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 造血细胞的体外扩增 MNC培养14 d后， 总细胞扩增倍数为1.78倍， 而CD34+细胞数量没有增加。

　　2.2 NOD/SCID小鼠的存活状况 对照组4只小鼠照射后出现萎靡、 倒毛的症状， 并在2周内相继死亡， 而未培养细胞组4只小鼠和培养后细胞组4只小鼠全部存活。

　　2.3 扩增造血细胞在NOD/SCID小鼠体内的植入情况 移植细胞6周后， 在存活小鼠的骨髓和脾脏中均可检测到CD45+CD34+细胞， 说明输注的人CD34+细胞已植入小鼠中。输注培养后CD34+细胞组小鼠的骨髓和脾脏中CD45+CD34+细胞的平均含量分别为28.49%和10.81%， 输注新鲜CD34+细胞组的小鼠的为24.48%和9.09%， 两组之间无统计学意义（P＞0.05）。该结果表明， 培养后CD34+细胞的植入能力与新鲜的CD34+细胞相近。进一步采用PCR法检测了小鼠骨髓和脾脏细胞中人源特异的ALU序列， 从分子水平验证人CD34+细胞在小鼠中的植入。作为阴性对照组的NOD/SCID小鼠中没有检测到人源ALU序列， 而在经半致死剂量放射照射后输注了新鲜或培养后的CD34+细胞的小鼠中均检测到了ALU序列(图1)， 表明人源细胞已经成功植入小鼠体内。

　　2.4 扩增造血细胞在NOD/SCID小鼠体内多系造血重建能力检测 在存活小鼠的骨髓和脾脏中均检测到CD45+CD3+细胞（T细胞）、 CD45+ CD19+细胞（B细胞）、 CD45+ CD33+细胞（髓系细胞）和CD45+CD71+细胞（红系细胞）。培养后细胞组小鼠骨髓中的各系细胞平均含量都较未培养细胞组高， 且T细胞、 B细胞和红系细胞的平均含量都显著高于未培养细胞组（P<0.05， 表1）; 同样， 培养后细胞组小鼠脾脏中的各系细胞平均含量都显著高于未培养细胞组（P<0.05， 表2）。上述结果表明， 培养后CD34+细胞的多系重建造血能力优于新鲜CD34+细胞。表 1 NOD/SCID小鼠骨髓内人源细胞各系抗原表达表 2 NOD/SCID小鼠脾脏内人源细胞各系抗原表达

　　2.5 NOD/SCID小鼠外周血象分析 为了动态观察移植后NOD/SCID鼠的造血恢复情况， 检测了实验小鼠在照射前（0 d）以及照射后第7天、 28天和第42天时外周血中白细胞（WBC）、 红细胞（RBC）和血小板（PLT）的含量（表 3）。可以看出， 受半致死剂量照射的影响， 在移植后第7天， NOD/SCID小鼠外周血中的WBC、 RBC和PLT的数量均较照射前减少， 其中WBC和PLT对照射较为敏感， 数量急剧下降。与未培养细胞组相似， 培养后细胞组小鼠外周血象各项参数在照射7 d后开始回升， 到42 d时基本恢复到照射前水平， 说明所植入的培养后的CD34+细胞也有助于小鼠的造血恢复。表 3 移植后小鼠外周血象恢复情况

　　3 讨论

　　目前对于造血干细胞体外扩增后能否维持其正常的生理功能尚存在争议。Piacibello等［4］报道在FL+MGDF＋SCF＋IL6体系中扩增4～10周后的脐血CD34+细胞的移植水平远远高于移植了相同数量的新鲜细胞的小鼠。Guenechea等［5］却认为扩增后的脐血CD34+细胞与新鲜的相比， 短期植入明显延迟。因此， 体外培养对脐血CD34+细胞生理功能的影响有待进一步研究。

　　我们采用SCF+ TPO + FL + IL3+ IL6细胞因子组合培养脐血MNC 14 d， 以NOD/SCID小鼠作为移植模型， 比较了培养前后的脐血CD34+细胞的造血重建功能。移植6周后， 在小鼠骨髓和脾脏中均可检测到人源CD45＋CD34+细胞， 经PCR验证在小鼠骨髓和脾脏的DNA中均存在人源ALU序列; 同时， 在小鼠体内均检测到人源T细胞、 B细胞、 髓系细胞和红系细胞， 表明新鲜和培养后的CD34+细胞都可以植入NOD/SCID小鼠中， 并且向各系分化。外周血象分析结果表明， 未培养细胞组和培养后细胞组小鼠， 在照后6周外周血象各项参数基本恢复到照前水平， 说明新鲜和培养后的CD34+细胞都有助于小鼠造血恢复。此外， 分析移植细胞在小鼠体内向各系细胞分化发现， 培养后CD34+细胞的多系重建造血能力优于新鲜CD34+细胞， 这可能是因为在体外培养过程中， 造血前体细胞数量增多， 并且产生了一些有利于植入的特定细胞［6］。

　　总之， 与新鲜CD34+细胞相同， 体外培养14 d后的CD34+细胞可以成功植入NOD/SCID小鼠体内， 实现各系造血重建， 促进小鼠的外周血象恢复正常， 且体外培养14 d后， CD34+细胞的植入能力与新鲜的CD34+细胞相近， 且其多系造血重建能力优于新鲜的CD34+细胞。

参考文献

［1］ Hofmeister CC， Zhang J， Knight KL， et al. Ex vivo expansion of umbilical cord blood stem cells for transplantation: growing knowledge from the hematopoietic niche［J］. Bone Marrow Transplant， 2007， 39(1): 11-23.

［2］ Astori G ， Adami V， Mambrini G， et al. Evaluation of ex vivo expansion and engraftment in NODSCID mice of umbilical cord blood CD34+ cells using the DIDECO ‘Pluricell System’［J］. Bone Marrow Transplant， 2005， 35: 1101-1106.

［3］ Xu R， Reems JA. Umbilical cord blood progeny cells that retain a CD34+ phenotype after ex vivo expansion have less engraftment potential than unexpanded CD34+ cells［J］. Transfusion， 2001， 41(2): 213-221.

［4］ Piacibello W， Sanavio F， Severino A， et al. Engraftment in nonobese diabetic severe combined immunodeficient mice of human CD34+ cord blood cells after ex vivo expansion: evidence for the amplification and selfrenewal of repopulating stem cells［J］. Blood， 1999， 93(11): 3736-3749.

［5］ Guenechea G， Segovia JC， Albella B， et al. Delayed engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice transplanted with ex vivoexpanded human CD34+ cord blood cells［J］. Blood， 1999， 93 (3)， 1097-1105.

［6］ Rice AM， Wood JA， Milross CG， et al. Prolonged ex vivo culture of cord blood CD34+ cells facilitates myeloid and megakaryocytic engraftment in the nonobese diabetic severe combined immunodeficient mouse model［J］. Br J Haematol， 2001， 114(2): 433-443.