ImmunoAIF△1480融合蛋白对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用

　　　　 作者：韩涛， 张勇， 孙书明， 任君琳， 李伟， 郭张燕， 孟艳玲， 杨安钢

【摘要】 目的: 观察免疫促凋亡分子ImmunoAIF△1480对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用。方法: 利用PCR的方法将九聚精氨酸编码序列(R9)与AIF C末端结构域编码区重组， 然后将R9AIF△1480基因与pCMVe23sFv载体重组， 构建免疫促凋亡分子ImmunoAIF△1480真核表达载体。用脂质体法转染CHO细胞， 经G418筛选， 建立稳定转染的细胞株， 通过RTPCR、 Western blot、 流式细胞术(FCM)等方法检测重组基因在转染细胞中的表达及其对HER2阳性肿瘤细胞的特异性杀伤活性。结果: 经过酶切鉴定与测序证实， 带有ImmunoAIF△1480基因的真核表达载体构建成功， 经RTPCR、 Western blot可检测到培养上清中免疫促凋亡基因的表达， 用FCM检测发现融合蛋白ImmunoAIF△1480对HER2阳性肿瘤细胞SGC7901和SKBR3有明显的促凋亡活性， 而对不表达HER2分子的ECV304细胞几乎没有影响。结论: ImmunoAIF△1480可以特异性杀伤HER2阳性肿瘤细胞。

【关键词】 凋亡诱导因子; HER2阳性肿瘤细胞; 细胞凋亡

　　凋亡诱导因子（apoptosisinducing factor， AIF）是1996年发现的一种凋亡诱导蛋白， 全长为613个氨基酸， 成熟的AIF分子长为559个氨基酸， 由3部分构成: 1个FAD结合结构域（122262aa和400477aa）， 1个NADH结合结构域（263399aa）和1个C末端结构域（481610aa）。AIF是一种双功能分子， N末端的FAD结合结构域及NADH结合结构域发挥着氧化还原酶的作用， 而分子C末端结构域具有促凋亡活性。AIF在细胞中表达后定位于线粒体膜间隙中［1］， 当凋亡信号刺激时， 可检测到AIF分子从线粒体释放到细胞质， 然后转位到细胞核内， 直接介导细胞核发生凋亡［2-4］。之后， 研究人员在细胞中又发现了AIF的另一种亚型AIFsh(353613aa)， 该亚型与AIF具有相似的促凋亡功能［5］。

　　鉴于AIF在细胞凋亡中具有的独特功能， 我们拟进一步探索其在基因治疗中应用的可能性。在成功克隆AIF△1120基因的基础上［6］， 我室刘湘丽等［7］对AIF基因的结构进行了进一步截短， 构建了仅保留AIF分子C端(481613位aa)的AIF△1480基因， 并证明AIF△1480基因仍具有促凋亡活性， 说明AIF分子的氧化还原酶活性与促凋亡活性可以分离而不受影响。在本实验中， 我们将AIF△1480基因与具有转膜作用的九聚精氨酸（R9）基因及识别HER2抗原的单链抗体e23sFv基因重组， 构建了免疫促凋亡分子ImmunoAIF△1480基因表达载体， 观察表达的免疫促凋亡分子对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 pcDNA3e23sFvPEⅡAIF△1120(ImmunoAIF△1120)质粒由第四军医大学免疫学教研室(本室)构建， 载体pCMVe23sFv由杨安钢教授构建。E.coli DH5α菌种、 中国仓鼠CHO细胞系、 SGC7901细胞系、 ECV304细胞系、 SKBR3细胞系为本室保存和培养。载体pCMV4由本室保存， Taq DNA聚合酶、 DNA限制性核酸内切酶、 T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司、 新生牛血清购自杭州四季青生物公司。RPMI1640培养基及脂质体LipofectAMINETM2000购自Invitrogen公司。山羊抗人AIF多克隆抗体购自Santa Cruz公司。HRP标记兔抗山羊二抗购自中杉公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计 根据AIF的基因序列设计引物为h3 (5′TTT GCG GCC GCG AAA AGA CGG AGG AGA CGC AGG CGG AGA AGG ATG TTC TGG AGT GAT3′)和zy2（5′TTT TCT AGA GTC GAC TCA GTC TTC ATG AAT GTT GAA TAG3′）。

　　1.2.2 pCMVe23sFvR9AIF△1480真核表达载体的构建 以质粒pcDNA3AIF△1120为模板， 用h3和zy2进行PCR， 扩增出带有R9的AIF△1480基因。用NotⅠ和XbaⅠ分别双酶切pCMVe23sFv与R9AIF△1480， 胶回收， T4 DNA连接酶连接， 并转化E.coli DH5α菌株， 挑克隆， 提取质粒， 酶切鉴定， 鉴定正确的克隆由北京奥科公司测序， 将测序正确的质粒命名为ImmunoAIF△1480。

　　1.2.3 细胞转染和稳定建系 于细胞转染前24 h， 用胰酶消化生长至对数期的CHO细胞， 置于细胞培养瓶中培养， 待细胞达80%汇合率时进行转染细胞。先用无血清RPMI1640液洗2次， 加500 μL无血清RPMI1640， 分别将8 μg ImmunoAIF△1480， ImmunoAIF△1120质粒DNA和20 μL LipofectAMINETM2000分别加于500 μL无血清RPMI1640液中， 轻轻振摇混匀， 制成转染液， 室温静置20　　 min后， 将转染液加入细胞中， 轻轻混合， 置37℃孵育6 h， 弃去转染液， 加含100 mL/L新生牛血清的RPMI1640。于转染后48 h用含800 mg/L　　 G418的上述培养液培养， 隔2 d换液， 约3周左右筛选出耐药的混合克隆。

　　1.2.4 RTPCR 收集稳定建系的细胞， 使用TRIzol reagent提取总RNA ， 使用SuperScriptTM FirstStrand System for rtPCR试剂盒进行反转录， 操作均按说明书进行。分别以cDNA为模板， ImmunoAIF△1480用鉴定引物htjS 5′TGTAGACAAGTCGTCCAGC3′和htjA 5′GTTCCATAGCACAATCCC3′， ImmunoAIF△1120单链抗体鉴定引物p1 5′CCC AAG CTT GAC GTC CAG CTG ACC CAG3′和 p2 5′GTT TGC GAC GCG CGG CCG CGG AGA CGG TGAC3′进行鉴定。

　　1.2.5 Western blot检测 稳定转染的各组CHO细胞在T75大培养瓶中培养， 处于对数生长期的细胞铺满培养瓶地面约80%后， 撤去血清， 用无血清培养液培养48 h， 收集上清， 经10 000 MWCO MILLIPORE， 4 000 g离心40 min后， 将浓缩的分泌蛋白加入5×上样缓冲液， 煮沸。将已处理好的蛋白样品进行SDSPAGE电泳， 电压分别为浓缩胶100V， 分离胶120V、 100 mA转移1 h至NC膜上。将NC膜在封闭液（30 g/L BSA in TBS）中， 在室温下缓慢摇动封闭1 h。加入1∶1 000的山羊抗人AIF蛋白的多克隆抗体， 4℃过夜。用TBST洗膜， 5 min×3次。加入1∶2 000的HRP标记的兔抗山羊二抗， 室温放置1h， TBST洗膜， 5 min×3次。加入发光液， 暗室内压片、 显影、 定影。

　　2 结果

　　2.1 ImmunoAIF△1480的克隆及鉴定 以pcDNA3AIF△1120质粒为模板， 用引物h3和zy2进行PCR， 扩增出约为440 bp的片段（图1）， 与预期大小一致， 将该片段经NotⅠ和XbaⅠ双酶切后， 连接入经NotⅠ和XbaⅠ双酶切后的pCMVe23sFv载体中， 经HindⅢ和XbaⅠ， HindⅢ和NotⅠ， NotⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定， 测序证实我们所获得的序列完全正确， 载体pCMVe23sFvR9AIF△1480 (ImmunoAIF△1480)构建成功 (图2)。

　　图1 R9AIF△1480基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳分析

　　1: DL 2 000 marker; 2: R9AIF△1480基因.

　　2.2 ImmunoAIF△1480和ImmunoAIF△1120稳定建系细胞中的表达 提取建系细胞总RNA并反转录， 分别以htjS和htjA、 p1和p2为上下游引物PCR检测ImmunoAIF△1480和ImmunoAIF△1120的表达， 分别扩增出约480 bp， 710 bp片段， 与预期大小一致， 证明转染细胞中有重组基因mRNA的表达（图3）。

　　2.3 CHO转染细胞培养上清中免疫促凋亡分子的表达 收集稳定转染的CHO细胞培养上清， 经超滤离心后， 得到浓缩的分泌蛋白样品， 用抗AIF C末端抗体， 经Western blot检测到重组蛋白的存在（图4）， 表明CHO建系细胞能够分泌产生重组蛋白。

　　2.4 建株细胞培养上清对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用 取建株CHO细胞培养上清， 培养HER2阳性的SKBR3， SGC7901细胞和HER2阴性的ECV304细胞， 每天换液， 48 h后， 用Annexin V染色， 经FCM检测细胞凋亡情况。结果显示， 普通培养液和含ImmunoAIF△1120， ImmunoAIF△1480分泌蛋白培养上清培养SKBR3细胞， 凋亡率分别为4.2%， 7.4%， 12.8%。 普通培养液和含ImmunoAIF△1120， ImmunoAIF△1480分泌蛋白培养上清培养SGC7901细胞， 凋亡率分别为3.9%、 8.3%、 12.9%。 普通培养液和含ImmunoAIF△1120， ImmunoAIF△1480分泌蛋白培养上清培养ECV304细胞， 凋亡率分别为3.8%、 5.9%、 5.7%。说明含重组蛋白的分泌上清对HER2阳性肿瘤细胞有明显的杀伤作用， 而对HER2阴性的肿瘤细胞没有明显的影响（图5）。

　　3 讨论

　　HER2是一种原癌基因编码的表皮生长因子受体， 在乳腺癌、 卵巢癌等肿瘤中高度表达， 而在正常细胞中不表达， 这种肿瘤特异性抗原可以作为肿瘤靶向治疗的候选分子实现肿瘤治疗过程中的特异性。Furin蛋白酶是体内一种重要的蛋白内切酶， 九聚精氨酸作为连接抗体部分和效应分子的连接肽， 被Furin切割， 效应分子被释放并随后被转运至胞浆中发挥作用［8］。

　　以往的研究证实AIF△1120［6］及 AIF△1352［1］等截短分子均具有促凋亡活性， 因此我们在此工作基础上进一步截短AIF分子以研究其功能。AIF的促凋亡作用不受caspases的抑制剂(如zVAD．fmk， IAP等)的抑制， 也不受上游凋亡信号的控制， 具有作为肿瘤杀伤分子特殊的优越性。我们对AIF基因进行了改造， 构建了ImmunoAIF△1480基因， 并初步证实仍具有促凋亡活性。利用抗HER2的抗体能够实现对HER2阳性肿瘤细胞的靶向识别， 将具有细胞毒性的蛋白运输至肿瘤细胞进行杀伤肿瘤细胞， 而对机体正常细胞不造成伤害［9］的特性， 将AIF△1480、 带有能被Furin蛋白酶切割的连接肽九聚精氨酸， 与识别HER2的单链抗体共同克隆入pCMV4真核表达载体后， 转染CHO细胞， 稳定建系。收集建株CHO细胞培养上清， 培养HER2阳性的SKBR3， SGC7901细胞和HER2阴性的ECV304细胞， 经流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示， 与普通培养液培养细胞相比， ImmunoAIF△1120， ImmunoAIF△1480细胞培养上清培养SKBR3细胞和SGC7901细胞， 凋亡率明显升高， 而培养ECV304细胞， 凋亡率变化并不明显， 说明含重组蛋白的分泌上清对HER2阳性肿瘤细胞有明显的杀伤作用， 而对HER2阴性的肿瘤细胞没有明显的影响。

　　和AIF基因相比， 这种截短型AIF基因由于具有分子量小的特征， 更有利于应用， 并且以Furin识别肽连接抗体和效应分子既能保证抗体的靶向识别， 又能实现有效杀伤HER2阳性肿瘤细胞。由于外源蛋白序列的减少， 免疫原性大大降低， 有利于临床长期反复使用， 有望为肿瘤生物治疗提供一种新的策略。

参考文献

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［2］ Daugus E， Susin SA， Zamzarm N， et al． Mitoehondrionuclear translocation of AIF in apoptosis and necrosis［J］． FASEB J， 2000， 14(5): 729-739.

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［7］ 刘湘丽， 于翠娟， 许彦鸣， 等. 人截短型凋亡诱导因子AIF△1480的表达对HeLa细胞的促凋亡作用［J］. 第四军医大学学报， 2005， 26(6): 484-487.

［8］ Wang T， Zhao J， Ren JL， et al． Recombinant immunoproapoptotic proteins with furin site can translocate and kill HER2positive cancer cells［J］. Cancer Res， 2007， 5; 67(24): 11830-11839.

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