抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的制备与鉴定

【摘要】 目的: 制备抗人绒毛膜促性腺激素(HCG)的单克隆抗体(mAb)。方法: 利用从人工流产刮宫物中提取的HCG免疫BALB/c小鼠， 取其脾细胞同NS1小鼠骨髓瘤细胞融合， 采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞株， 并对mAb的亚型、 亲和力及特异性进行鉴定。结果: 共获得26株能稳定分泌抗HCG特异性mAb的杂交瘤细胞株。mAb的亚类均为IgG1， 亲和力介于1.14×108～2.0×108 mol/L之间， 其中4株mAb与HCG的β亚基有较强的反应， 而与黄体激素(LH)、 促卵泡激素(FSH)、 促甲状腺激素(TSH)均无交叉反应。结论: 成功获得4株鼠抗人HCG mAb的杂交瘤细胞株， 其分泌的mAb能特异识别人HCG的β亚基， 可用于早孕、 肿瘤等诊断的进一步研究。

【关键词】 人绒毛膜促性腺激素; 杂交瘤细胞株; 单克隆抗体

　　人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin， HCG)是人类受孕后胎盘合体滋养层细胞分泌的维持正常妊娠必需的一种糖蛋白激素。HCG分子含有两个亚基， 分别为α和β亚基。两个亚基的分子结构不同， 以二硫键将两个亚基连结在一起形成二聚体结构， HCG的生物学活性和免疫学特性由β亚基决定［1］。在妊娠早期HCG的浓度迅速增高， 监测尿中的HCG即可证实妊娠［2］。另外， HCG的含量与许多异位HCG表达的肿瘤有密切关系， 可将HCG看作是相关的肿瘤标志物之一［3］， 因此， HCG的检查不仅对早孕检测具有重要意义， 而且可对滋养层细胞肿瘤和非滋养层细胞肿瘤的诊断与鉴定提供依据。抗HCG单克隆抗体(mAb)的研制， 在早孕诊断、 先兆流产的预测以及肿瘤的诊断方面上具有十分重要的意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 人工流产刮宫物由郑州某医院提供。BALB/c小鼠由郑州大学医学院实验动物中心引进。小鼠骨髓瘤细胞株NS1为本室保存。细胞培养板为CORNING公司产品。酶标仪为AUTOBIO 2010产品。DMEM培养液为Gibco公司产品。血清购自上海维群公司。HCG亚型鉴定试剂盒、 弗氏完全佐剂、 弗氏不完全佐剂、 培养液添加剂HAT、 丙酮酸钠、 L谷氨酰铵、黄体激素(LH)、 促卵泡激素(FSH)、 促甲状腺激素(TSH)， 均为Sigma公司产品。HCG、 αHCG、 βHCG购自USBIO。HCG定量检测试剂盒， 购自上海天呈科技有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫用HCG的制备 将人工流产刮宫物于4℃、 以4 000 r/min离心30 min后， 收集上清并向其中加入等量的950 mL/L的冷乙醇， 搅拌过夜。次日， 于4℃， 以4 000 r/min离心30 min。收集上清， 用0.05 mol/L醋酸缓冲液溶解沉淀， 然后重复第1步， 合并两次所得上清。向上清中加入950 mL/L的冷乙醇使之终浓度达到80%， 于4℃静置过夜。次日， 于4℃、 以4 000 r/min离心30 min， 收集沉淀， 用0.05 mol/L醋酸缓冲液溶解沉淀， 再重复1次抽提与沉淀过程。收集沉淀， 溶解于生理盐水中， 用紫外分光光度计测定蛋白含量［4， 5］。取膨胀好的DEAE纤维素DE52， 经酸碱处理后， 用0.02 mol/L、 pH7.0的磷酸缓冲液充分平衡填装2 cm×30 cm的层析柱。将在上述缓冲液中充分透析的HCG 300 mg上柱， 用3倍体积的缓冲液淋洗。然后用含0.2 mol/L NaCl的上述缓冲液进行梯度洗脱。收集蛋白峰， 用HCG定量检测试剂盒测定HCG的含量， 合并含量较高的组分， 浓缩到1 g/L左右。用SDSPAGE分析蛋白质的纯度， 并用紫外分光光度计测得的蛋白含量和用试剂盒测得的HCG含量之比， 估计产物的纯度， 过滤除菌后分装， 于-20℃保存。

　　1.2.2 免疫动物 选择6～8周龄的BALB/c小鼠， 体质量约20 g， 以纯化的HCG免疫， 每次免疫剂量均为100 μg/只。首次免疫与等量的弗氏完全佐剂充分乳化， 第2次与第3次免疫与等量的弗氏不完全佐剂充分乳化， 均为腹腔注射， 每次间隔10～15 d， 融合前3 d脾脏加强免疫1次［6］。

　　1.2.3 杂交瘤细胞株的建立 采用常规方法进行细胞融合， 所用PEG的相对分子质量（Mr）为1 500。用间接ELISA筛选分泌抗HCG的阳性克隆， 先用HCG鉴定， 然后用游离的α和β亚单位进行区分。杂交瘤细胞的克隆化及腹水制备均按实验室常规进行。

　　1.2.4 mAb的特性鉴定 （1）Ig亚类的鉴定: 采用亚类鉴定试剂盒进行鉴定。（2）亲和性测定: mAb腹水经倍比稀释测定效价以后， 采用非竞争酶免实验法测定。（3）特异性鉴定: 按间接ELISA法， 以HCG、 αHCG、 βHCG、 LH、 FSH、 TSH分别包被酶免板， 检测所获得mAb的交叉反应性。

　　2 结果

　　2.1 杂交瘤细胞株的建立 经筛选、 克隆化共获得可分泌抗HCGmAb的杂交瘤细胞26株， 其中针对αHCG的10株， 针对βHCG的4株， 针对HCG的12株， 见表1。将阳性克隆冻存于液氮中， 每隔1个月复苏1次， 用ELISA方法检测复苏后细胞培养上清的效价， 结果表明26株杂交瘤细胞经10次冻存复苏和20代传代均能够比较稳定的分泌mAb。表1 抗HCG mAb的特异性鉴定(A490值)

　　2.2 HCG的纯化 纯化前， 人工流产刮宫物中HCG的含量经HCG定量检测试剂盒测定约为100 IU/mL， 纯化产物经紫外分光光度计测定蛋白总量为10 mg， 用HCG定量检测试剂盒测定约为2 500 IU/mL。经SDSPAGE分析纯化的蛋白目的条带Mr 39区带占总区带的50％以上（图1）。

　　2.3 mAb的特性鉴定 (1)Ig亚类: 经试剂盒测定4株mAb亚类均为IgG1。(2)亲和力: 4株mAb的亲和力介于1.14×108～2.0×108 mol/L之间。(3)特异性: 4株与HCG β亚基有较强反应的杂交瘤细胞株培养上清液与LH、 FSH、 TSH无交叉反应; 而与HCG α亚基有较强反应的杂交瘤细胞株培养上清液与LH、 FSH、 TSH有不同程度的交叉反应（表1）。

　　3 讨论

　　抗体是构成机体免疫力的一类重要物质， 也是医学及兽医学中用于疾病诊断、 治疗、 预防和研究发病机制的极为重要的常用试剂或制剂。mAb因其结构相同、 成分均一、 特异性强、 生物学活性高等特性， 对抗原的生物学特性、 抗原性研究， 以及对与抗原有关的疾病的诊断、 治疗， 以及免疫机制的研究等均具有重要意义。mAb制剂已成为生物医学研究中用作检测及治疗的重要工具。

　　我们通过从人工流产刮宫物提取HCG， 保证了其良好的免疫原性， 能够确保抗体的亲和力以及特异性， 是一种较为有效的方法。HCG与来自脑垂体的一些糖蛋白如LH、 FSH和TSH等结构相似， α链的氨基酸排列顺序基本相同， 而代表HCG特异性的仅是β链羧基末端约30个氨基酸的片段， 因此， 得到与β亚基有较强反应的mAb更有意义。在实验中我们得到了4株抗β亚基的mAb， 与HCG的β亚基的反应明显， 且与LH、 FSH、 TSH无交叉反应， 具有较好的特异性和实用性， 为早孕、 肿瘤的诊断及计划生育的进一步研究奠定了物质基础。但总体β亚基抗体获得数较少， 说明用整分子HCG作为免疫原制备针对HCG β亚基的mAb有一定困难。是否可以通过真核表达人HCG β亚基或将HCG β亚基与载体蛋白偶联进行免疫来提高针对HCG β亚基mAb的获得率， 还有待进一步研究。

参考文献

［1］ 郑亦辉. 动物激素及其应用［M］. 南京: 江苏科学技术出版社， 1996: 145-175.

［2］ 杨廷富. 人绒毛膜促性腺激素的临床意义及检测进展［J］. 检验医学与临床， 2007， 4(10): 976-978.

［3］ Acevedo HF， Tong JY， Hartsock RJ. Human chorionic gonadotropin beta subunit gene expression in culture human fetal and cancer cells of different types and origin［J］. Cancer， 1995， 76(8): 1467-1475.

［4］ 李立权， 袁鸿锦， 张鸿志， 等. 人工流产刮宫物中绒毛膜促性腺激素的提取和纯化［J］. 兽医大学学报， 1991， 11(4): 374-378.

［5］ 杨银书， 杜全木. 人工流产物中的HCG的分离与纯化［J］. 生物化学与生物物理进展， 1992， 19(4): 324-324.

［6］ Spitz M， Spitz L， Thorpe R， et al. Intrasplenic primary immunization for the production of monoclonal antibodies［J］. J Immunol Methods， 1984， 70(1): 39-43.