人高迁移率族B1蛋白原核表达、 纯化及抗体制备和初步应用

　　　　 作者：田爽， 刘民， 李欣， 浦永， 吴海东， 汤华

【摘要】 目的: 原核表达并纯化人高迁移率族B1蛋白(HMGB1)免疫日本大耳白兔制备其抗体。方法: 构建原核表达质粒pRsetA2HMGB1， 转化大肠杆菌BL21(DE3)， HMGB1蛋白经异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。融合蛋白通过Ni2+NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备抗体血清。以间接ELISA法检测抗体效价， Western blot和免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果: 成功构建原核表达质粒， 表达并纯化HMGB1蛋白。ELISA检测抗体效价为1∶16 000以上， Western blot和免疫荧光染色确定抗体具有高度特异性。结论: HMGB1蛋白和抗体的成功制备， 为下一步研究将HMGB1作为肿瘤等疾病治疗的新靶点奠定基础。

【关键词】 HMGB1; 原核表达; 抗体; 癌症

　　高迁移率族蛋白(HMG蛋白)因其相对分子质量小(Mr&<30 000)， 在聚丙烯酰胺凝胶电泳中快速迁移而被命名。人高迁移率族B1蛋白(high mobility group box 1， HMGB1)基因位于染色体l3q12， 它包括3个不同的功能区， N末端(A区和B区)富含带正电荷的赖氨酸， 而C末端(C区)富含带负电荷的天冬氨酸和谷氨酸［1］。HMGB1蛋白在胞内外都有分布， 根据其分布不同而发挥不同的生物学效应。细胞核HMGB1参与构建核小体， 维持其稳定性， 同时在DNA重组、 复制、 修复和基因转录中起重要的辅助作用。细胞外HMGB1具有细胞因子特性， 它与细胞分化、 迁移、 增殖、 凋亡以及炎症反应的诱导等密切相关［2］， 而且在人类病理状态下如Alzheimer’s病、 败血症、 局部缺血再灌注损伤、 关节炎和癌症中， 都伴随着HMGB1蛋白的失调。尤其是在癌症包括乳腺癌、 结肠癌、 前列腺癌、 肺癌等中， HMGB1蛋白过表达与肿瘤的增殖和转移有关［3］。本研究中原核表达HMGB1蛋白、 纯化并制备其抗体， 为深入研究将HMGB1作为肿瘤等相关疾病治疗的新靶点起到了基础性作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 人淋巴细胞RNA逆转录产物， 原核表达载体pRsetA2(由本实验室在pRsetA基础上改建而成， 将EcoR I和Xho I位点调换)， 大肠杆菌XL1Blue、 BL21(DE3)， 肿瘤细胞系均由本实验室保存。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成; Taq DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶、 标准蛋白marker购自Ferments公司; 各种限制性内切酶购自TaKaRa公司; DNA marker、 日本大耳白兔、 抗GADPH抗体、 辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG购自赛尔生物科技有限公司; Ni2+NTA Superflow层析纯化树脂购自Qiagen; 异硫氰酸(FITC)标记的驴抗兔IgG购自Jackson Immunoresearch Laboratories。其他所用化学试剂均为分析纯以上产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计及目的片段的扩增 根据NCBI基因库中HMGB1编码区序列以及原核表达载体pRsetA2上的多克隆位点， 通过Primer Premier5.0软件设计上下游特异性引物如下: 5′GACGAATTCGCCACCATGGGCAAAGGAGATCCTAAG3′(划线处为EcoR I酶切位点) 5′GCTCACCTCGAGGCTTCATCATCATCATCTTCTTCTTCATC3′(划线处为Xho I酶切位点)。以人淋巴细胞RNA逆转录产物为模板进行PCR， 扩增条件为: 94℃预变性4 min， 然后94℃变性1 min、 58℃退火1 min、 72℃延伸1 min， 共31个循环， 最后72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖(10 g/L)凝胶电泳后， 由凝胶成像系统拍照并鉴定。

　　1.2.2 原核表达质粒的构建 PCR回收产物和pRsetA2空载体以EcoR I和Xho I双酶切， 37℃水浴过夜后， 进行琼脂糖(10 g/L)凝胶电泳并回收， 然后在T4 DNA连接酶作用下室温连接4 h， 转化E.coli XL1Blue， 通过氨苄青霉素(Amp+)抗性筛选得到重组子。挑取阳性克隆小提质粒DNA并双酶切鉴定。

　　1.2.3 pRsetA26hisHMGB1融合蛋白的诱导表达 鉴定正确的质粒转化E.coli BL21(DE3)， 涂布于Amp+抗性的LB平板37℃过夜培养。然后挑取单克隆于2 mL LB中， 37℃ 230 r/min振荡培养过夜。次日按1∶20比例接种培养物到10 mL新鲜的LB中， 37℃ 230 r/min振荡培养约2 h， 直到A600=0.5-0.7。取1 mL作为诱导前对照， 其余的加入IPTG至终浓度为1 mmol/L， 30℃继续振荡培养4 h。然后5 000 g离心5 min， 去上清收集菌体， 加入Buffer B(100 mmol/L Nah3PO4， 10 mmol/L Tris·Cl， 8 mol/L urea， pH8.0)重悬菌体后超声裂解， 10 000 g离心10 min留取上清。取部分上清加入上样缓冲液(含有100 mL/L β巯基乙醇)水浴煮沸5 min， 冰置待上样， 进行SDSPAGE电泳， 考马斯亮蓝染色分析。

　　1.2.4 融合蛋白的纯化 将表达融合蛋白的菌液转接到300 mL LB中扩大培养， 并按上述条件诱导表达和裂解菌体， 然后离心将上清液加到Ni2+NTA树脂中， 4℃旋转混匀30 min， 加入Buffer C(100 mmol/L Nah3PO4， 10 mmol/L Tris·Cl， 8 mol/L urea， pH6.3)洗涤柱床去除杂蛋白， 再加入Buffer D(100 mmol/L Nah3PO4， 10 mmol/L Tris·Cl， 8 mol/L urea， pH4.5)洗脱目的蛋白， 最后洗脱液经磷酸盐缓冲液(PBS)透析后-20℃保存。其中每一步流下的液体取部分上样进行SDSPAGE分析。

　　1.2.5 免疫兔子制备抗体血清 取200 μg蛋白与弗氏完全佐剂按1∶1比例混合后皮下注射初次免疫兔子， 以后每间隔2周， 取200 μg蛋白与弗氏不完全佐剂按1∶1比例混合加强免疫2次， 1周后兔耳缘静脉取血检测抗体效价并加强免疫1次， 如达到所需效价值7 d后取全血。

　　1.2.6 间接ELISA法检测抗体效价 以终浓度为1 g/L的HMGB1蛋白包被ELISA反应孔， 一抗是作为空白对照的PBS、 阴性对照的免疫前兔血清以及倍比稀释的抗HMGB1抗体， 二抗为HRP羊抗兔IgG(1∶20 000)， 最后加入底物显色后， 用酶标仪测定A450的值。结果以实验组值-空白对照/阴性对照-空白对照≥2.5为阳性， 以出现阳性反应的最高稀释度作为抗体的效价。

　　1.2.7 Western blot和免疫荧光染色检测抗体特异性 (1)Western blot: SDSPAGE电泳后将蛋白电转(4℃， 恒流300 mA， 2 h)到硝酸纤维素膜(NC)上， 然后将NC膜在含50 g/L脱脂奶粉的TBST中室温封闭2 h后， 加抗HMGB1抗体(1∶200)室温作用3 h， TBST洗去未结合一抗， 再加HRP羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)室温作用1 h， TBST洗去未结合二抗， 加底物反应3 min后暗室曝光并观察结果。(2)免疫荧光染色: 将细胞接种于14孔板中， 细胞密度为2 000～4 000/孔， 37℃孵育过夜。24 h后加40 g/L多聚甲醛4℃作用30 min固定细胞， 再加入5 mL/L TritonX100［4］， 4℃透化处理20 min。然后加100 mL/L驴血清封闭1 h后， 加抗HMGB1抗体(1∶50)4℃作用过夜。次日加FITC驴抗兔IgG二抗(1∶200)4℃作用1 h， 再加DAPI 4℃染色5 min， 最后加封片剂， 荧光显微镜下观察并拍照。

　　2 结果

　　2.1 PCR扩增的目的片段 经特异性引物进行PCR扩增后， 琼脂糖凝胶电泳可得到644 bp的目的条带(图1)。

　　2.2 验证原核表达质粒 重组质粒pRsetA2HMGB1经EcoR I和Xho I双酶切后出现644 bp的目的条带(图2)， 说明重组质粒构建成功。图2 pRsetA2HMGB1原核表达质粒的酶切鉴定

　　2.3 鉴定诱导表达的HMGB1蛋白 将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)， 以IPTG诱导蛋白表达， 表达产物经SDSPAGE电泳后考马斯亮蓝染色在Mr约为30 000处可见一明显蛋白条带(图3)。且与预期蛋白大小相符， 由此确定HMGB1蛋白表达成功。

　　2.4 融合蛋白的纯化 融合蛋白经Ni2+NTA树脂亲和纯化后进行SDSPAGE， 结果显示目的蛋白得到了高度纯化， 纯度可达90%以上， 而且经标准蛋白BSA标化后浓度约为1 g/L(图4)。

　　2.5 抗体效价的检测 通过间接ELISA法进行检测后， 抗体效价可达到1∶16 000， 而作为阴性对照的免疫前兔血清显色呈阴性。

　　2.6 抗体特异性的分析 (1)用纯化的HMGB1蛋白免疫兔子后得到兔抗人HMGB1抗体， Western blot分析显示此抗体可特异性与大肠杆菌经IPTG诱导所产生的HMGB1蛋白结合， 与菌体其他成分无交叉反应(图5A)。(2)HMGB1蛋白在多种肿瘤中都有表达， 收集肿瘤细胞系前列腺癌PCM2B4、 肺癌A549、 乳腺癌MDMBA231和MCF7、 结肠癌SW620、 宫颈癌HeLa、 白血病Jurkat细胞裂解物， 采用Western blot检测发现在Mr约为30 000处出现目的条带， 与文献报道的蛋白大小相符［5］， 表明此抗体可特异性识别内源性HMGB1蛋白 (图5B)。(3)在MDMBA231和A549细胞中， 免疫荧光染色显示HMGB1蛋白存在于细胞质中， 说明此抗体具有结合天然抗原的能力(图6)。

　　3 讨论

　　HMGB1蛋白是近几年发现的与肿瘤生长、 迁移、 侵袭密切相关的染色质蛋白， 而且相对正常组织来说， 它在多种肿瘤组织中是过表达的［3］。肿瘤细胞在侵袭转移期间HMGB1蛋白会与其配体晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products， RAGE)相互作用， 激活MAPK、 P38MAPK， JNK和P42/P44MAPK等信号通路， 继而引起基质金属蛋白酶MMP2和MMP9激活， 使细胞外基质降解促进肿瘤浸润和转移［6］。这表明如果人为阻断信号途径可能会抑制肿瘤的迁移， 而其中应用抗HMGB1抗体降低HMGB1水平是直接而有效的途径之一。最早应用抗HMGB1抗体是在炎症反应实验中， 实验发现抗HMGB1多克隆抗体可使LPS致死量攻击的小鼠生存率由0升至70%， 并且随着抗体剂量的加大， 最终可达100%［7］。同时抗HMGB1多克隆抗体也可明显减轻关节炎症状、 改善体重下降和关节组织的病理改变［8］。新近研究也显示， 应用抗HMGB1抗体进行干预后， 对严重内毒素血症、 脓毒症、 关节炎以及内毒素诱导的急性肺损伤均有积极的治疗作用。即使抗HMGB1抗体应用时机较晚， 仍可显著改善动物症状和预后［9］。这些研究为抗HMGB1抗体应用于炎症、 肿瘤等相关疾病治疗提供了实践基础， 使抗体治疗成为可能。

　　利用基因工程技术表达外源蛋白选择合适的表达载体是至关重要的。具有T7启动子的原核表达载体pRsetA2， 在未诱导前转录不启动， 蛋白不会泄漏表达， 不会影响宿主菌的生长。同时此载体N端带有6His， 即有利于纯化HMGB1融合蛋白， 又可增强免疫原性制备抗HMGB1抗体。本研究选用此载体成功构建了原核表达质粒pRsetA2HMGB1， 纯化HMGB1蛋白并制备了其抗体。经间接ELISA法检测该抗体效价可达1∶16 000， Western blot和免疫荧光染色确定， 抗HMGB1抗体不仅可以和原核表达的HMGB1蛋白特异性结合， 而且也可与多种肿瘤细胞系中内源性的HMGB1蛋白特异性结合。这为更深入研究与HMGB1蛋白相关疾病创造了有利条件。

参考文献

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［9］ 姚咏明， 刘 辉. 对高迁移率族蛋白B1作用的新认识［J］. 中国危重病急救医学， 2005， 17(7): 385-386.