人λ干扰素在BHK21中的表达及生物学活性的研究

　　　　 作者：严玉兰， 刘洋， 曹文雁， 步雪峰 步志高， 郑金旭

【摘要】 目的: 研究HuIFNλ1和HuIFNλ2真核细胞重组表达及其生物学活性。方法: 用水疱性口炎病毒（VSV）刺激人宫颈癌HeLa细胞， 用RTPCR克隆HuIFNλ1和HuIFNλ2基因， 与PCAGGEGFP真核表达载体连接， 构建重组体PCAGGHuIFNλ1和PCAGGHuIFNλ2并进行鉴定， 后在BHK21细胞进行表达， 采用VSV*GFP于人肺腺癌A549上进行表达产物抗病毒活性测定; 并通过已构建的MDBKMxpLuc细胞系对HuIFNλ1和HuIFNλ2诱导MxA抗病毒蛋白产生的特性进行研究。结果: HuIFNλ1PMD18T Vector和HuIFNλ2PMD18T Vector的SacⅠ、 XhoⅠ和SacⅠ和SalⅠ双酶切鉴定， 均出现610 bp大小的带， 测序示与GenBank上报道的序列完全一致。PCAGGHuIFNλ1活性104 IU/mL， PCAGGHuIFNλ2活性为102 IU/mL， 且PCAGGHuIFNλ1诱导Mx抗病毒蛋白的表达一定时间内随时间延长表达不断增强， 9～12 h达高峰， 24 h后消失（P&<0.05）。结论: 成功构建了PCAGGHuIFNλ1PCAGGHuIFNλ2 的真核表达载体并在BHK21细胞中得到表达， 其抗病毒活性与诱导Mx抗病毒蛋白密切相关。

【关键词】 干扰素λ; 基因转染; 生物活性

　　［Abstract］ AIM: To construct the eukaryotic expressing vector PCAGG HuIFNλ1 and PCAGGHuIFNλ2 and to study the biological activity of HuIFNλ1and HuIFNλ2. METHODS: The cDNA fragment encodding HuIFNλ1 and HuIFNλ2 was amplified from the total RNA extracted from virusinduced HeLa cells by RTPCR. Then it was cloned into the eukaryotic expressing vector PCAGGEGFP. The recombinant was transfected into BHK21 cells. VSV*GFPA549 system was used to measure the antivirus activity.The constructed cell line MDBKMxpLuc was used to study the characteristics of MxA protein induced by the products of PCAGGHuIFNλ1 and PCAGGHuIFNλ2. RESULTS: The recombinant vector HuIFNλ1PMD18T Vector was enzymed by SacⅠand XhoⅠ while HuIFNλ2PMD18T Vector was enzymed by SacⅠ and SalⅠ. The fragments were both 610 bp and they were consistent with nucleotide sequences reported in GenBank. The antivirus activity of protein expressed by PCAGGHuIFNλ1 and PCAGGHuIFNλ2 was 104 IU/mL and 102 IU/mL， respectively. The protein expressed by PCAGGHuIFNλ1 and PCAGGHuIFNλ2 induced the expression of the antivirus protein MxA. The expression of protein MxA induced by PCAGGHuIFNλ1 increased with the passage of time， reaching the peak during 9 to 12 hours and disappearing in 24 hours. CONCLUSION: The eukaryotic expressing vector of PCAGGHuIFNλ1 and PCAGGHuIFNλ2　　has been successfully constructed and transiently expressed in BHK21 cells. The antivirus activity of the products is closely correlated with inducing the expression of antivirus protein MxA.

　　［Keywords］INFλ; gene transfection; bioactivity

　　［摘 要］ 目的: 研究HuIFNλ1和HuIFNλ2真核细胞重组表达及其生物学活性。方法: 用水疱性口炎病毒（VSV）刺激人宫颈癌HeLa细胞， 用RTPCR克隆HuIFNλ1和HuIFNλ2基因， 与PCAGGEGFP真核表达载体连接， 构建重组体PCAGGHuIFNλ1和PCAGGHuIFNλ2并进行鉴定， 后在BHK21细胞进行表达， 采用VSV*GFP于人肺腺癌A549上进行表达产物抗病毒活性测定; 并通过已构建的MDBKMxpLuc细胞系对HuIFNλ1和HuIFNλ2诱导MxA抗病毒蛋白产生的特性进行研究。结果: HuIFNλ1PMD18T Vector和HuIFNλ2PMD18T Vector的SacⅠ、 XhoⅠ和SacⅠ和SalⅠ双酶切鉴定， 均出现610 bp大小的带， 测序示与GenBank上报道的序列完全一致。PCAGGHuIFNλ1活性104 IU/mL， PCAGGHuIFNλ2活性为102 IU/mL， 且PCAGGHuIFNλ1诱导Mx抗病毒蛋白的表达一定时间内随时间延长表达不断增强， 9～12 h达高峰， 24 h后消失（P&<0.05）。结论: 成功构建了PCAGGHuIFNλ1PCAGGHuIFNλ2 的真核表达载体并在BHK21细胞中得到表达， 其抗病毒活性与诱导Mx抗病毒蛋白密切相关。

　　［关键词］干扰素λ; 基因转染; 生物活性

　　Kotenko和Sheppard等2003年相继报道一组新型干扰素家族IFNλs， 包括IFNλ1、 IFNλ2和IFNλ3 3个成员（又称IL29、 IL28A 和IL28B）［1， 2］。IFNλs作为干扰素家族中的新成员， 具有与Ⅰ型干扰素类似的信号转导通路和生物学活性， 两者都是通过诱导受体异二聚体化， 但又有其独特的受体表达系统， 从而发挥抗病毒、 抗细胞增殖和免疫调节等生物学作用。IFNλs 的抗病毒活性与I型IFN相似， 但其对靶细胞有选择性［3］。IFNλs 可诱导几种抗病毒蛋白的表达［2］， 主要包括: 抗黏液病毒蛋白（MxA）及2’， 5’寡聚腺苷酸合成酶， 前者属于GTP酶类， 特异性作用于某一类病毒的蛋白质， 可阻断某些正黏病毒（如流感病毒）的复制［4］。本研究采用水疱性口炎病毒(vesic stomatovirus， VSV)病毒诱导人宫颈癌HeLa细胞， 经RTPCR技术克隆hIFNλ1、 hIFNλ2基因， 并与PCAGG真核表达质粒进行基因重组， 构建PCAGGhIFNλs真核表达载体， 在BHK21细胞中进行瞬时表达， 采用VSV*GFP于人肺腺癌A549上进行表达产物抗病毒活性检测， 并通过MDBKMxpLuc细胞系对hIFNλ1和hIFNλ2诱导产生MxA抗病毒蛋白特性进行研究。

1 材料和方法

　　1.1 材料 引物由上海生物工程有限公司合成; 内切酶购自TaKaRa公司; T4 DNA连接酶购自MBI公司; 胶回收和质粒小量提取试剂盒均购自上海华顺试剂公司。质粒中量提取试剂盒购自Qiagen公司; TRIzol总RNA试剂盒、 RTPCR试剂盒、 DMEM培养基和转染试剂Lipofectamin2000购自Invitrogen公司; 胎牛血清购自Gibco公司; 表达绿色荧光蛋白报告基因的重组水疱性口炎病毒VSV *GFP由中国农业科学院哈尔滨研究所构建、 滴定并保存; DH5α感受态细胞、 人肺腺癌A549、 BHK21细胞、 人宫颈癌HeLa细胞为中国农业科学院哈尔滨研究所提供; MDBKMxpLuc细胞系为中国农业科学院哈尔滨研究所人兽共患病研究室建立保藏［5］。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计 按GenBank报告的IFNλ1和IFNλ2基因全长序列设计引物。IFNλ1上游引入SacⅠ酶切位点和kozak序列， 下游引入XhoⅠ酶切位点; IFNλ2上游引物中引入Sac Ⅰ酶切位点和增强表达的kozak序列， 下游引入SalⅠ酶切位点。根据引物设计原则， 设计上下游引物如下: IFNλ1上游引物: 5′CTGAGCTCGCCACCATGGCTGCAGCTTGGAC3′， 下游引物: 5′GTCTCGAGTCAG GTGGACTCAGGGTG3′; IFNλ2上游引物: 5′AAGAGCTCGCCACCATGAAACTAGACATGACTGGGGACTGCAC3′， 下游引物: 5′TTGTCGACTCAGACACACAGGTCCCCAC3′。

　　1.2.2 HuIFNλ1和HuIFNλ2基因的RTPCR克隆 用VSV病毒按MOI 1.0感染HeLa细胞12 h后， TRIzol法提取HeLa细胞的总RNA， 以Oligo (dT)为反转录引物用Invitrogen反转录试剂盒反转录成cDNA模板进行PCR， PCR的循环条件: HuIFNλ1 95℃ 热启动预变性5 min， 95℃ 30 s， 62℃ 30 s， 72℃ 50 s ， 共30个循环， 72℃延伸10 min; HuIFNλ2 95℃热启动预变性5 min， 95℃ 30 s， 64℃ 30 s， 72℃ 50 s ， 共30个循环， 72℃延伸10 min。对扩增产物进行10 g/L琼脂糖电泳分析。

　　1.2.3 PCAGGHuIFNλ1和PCAGGHuIFNλ2真核表达载体的构建及筛选 HuIFNλ1和HuIFNλ2 cDNA的PCR产物用胶回收试剂盒回收， 用T4 DNA连接酶分别将上述回收的PCR产物与PMD18T Vector连接并转化至感受态大肠杆菌DH5α。挑取阳性克隆扩增后， 提取质粒HuIFNλ1PMD18T Vector和HuIFNλ2PMD18T Vector， 分别用SacⅠ、 XhoⅠ和SacⅠ和SalⅠ双酶切鉴定正确后送出上海生物工程有限公司测序。将测序正确的HuIFNλ1PMD18T Vector和HuIFNλ2PMD18T Vector质粒分别用SacⅠ、 XhoⅠ和SacⅠ和SalⅠ双酶切并用胶回收试剂盒回收， PCAGG载体用SacⅠ、 XhoⅠ酶切处理后胶回收， 将二者用T4 DNA连接酶连接并转化至感受态大肠杆菌DH5α， 挑取阳性克隆， 大量制备用于转染。

　　1.2.4 BHK21细胞的培养、 转染和实验分组 采用DMEM培养基（100 mL/L胎牛血清）常规培养BHK21细胞， 转染前1 d在6 孔板中接种密度为1×108/L的BHK21细胞。随后按Lipofectamin2000转染说明书， 将PCAGGHuIFNλ1、 PCAGGHuIFNλ2和PCAGG空载体（空白对照组）分别转染至BHK21细胞， 每组3 孔， 3 孔正常的BHK21细胞作为阴性对照组。转染时用无血清培养液， 6 h后换成100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液， 转染72 h后收集上清， 无菌保存备用。

　　1.2.5 HuIFNλ1、 HuIFNλ2抗病毒活性测定 用VSV*GFPA549细胞系统测定HuIFNλ1 、 HuIFNλ2抗病毒活性， 以细胞0.5×104个/孔密度将A549细胞铺于96 孔板， 待细胞贴壁后， 分别加入10～106不同倍数稀释的PCAGGHuIFNλ1和PCAGGHuIFNλ2转染上清， 37℃作用24 h， 并设空白对照和PCAGG空载体对照组。含20 mL/L FBS的DMEM稀释的VSV*GFP 3 000 Pfu/孔感染A549细胞， 1 h后换完全培养液， 24 h倒置荧光显微镜观察结果， 以荧光亮度为对照组50%的最高稀释度为一个病毒抑制单位（IU）。

　　1.2.6 HuIFNλ1和HuIFNλ2激活Mx启动子的生物学活性检测 细胞细胞克隆MDBKMxpLuc于24 孔板中过夜生长至密度约100％时， 分别加入以含50 mL/L FBS的DMEM 10倍稀释的PCAGGHuIFNλ1和PCAGGHuIFNλ2转染上清样品400 μL， 分别在3、 6、 9、 12、 15、 24 h参照高亮萤光素酶检测系统说明书检测IFN刺激Mxp表达的萤光素酶， 每个时间点都做3个平行孔， 并设未用IFN处理的空白孔和PCAGG空质粒转染上清处理的对照组。

　　2 结果

2 .1 HuIFNλ1、 HuIFNλ2基因克隆和PCR产物分析 经VSV病毒诱导12 h的人HeLa细胞mRNA用RTPCR扩增。其产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳， 出现大小约为617 bp， 条带大小与所需克隆的HuIFNλ1、 HuIFNλ2基因大小相一致（图1）。

　　2.2 HuIFNλ1PMD18T Vector和HuIFNλ2PMD18T Vector的酶切鉴定和测序 将克隆的HuIFNλ1和HuIFNλ2cDNA目的基因与Vector 测序载体重组连接后， 转化至感受态大肠杆菌DH5α， 挑取阳性克隆扩增后， 提取质粒HuIFNλ1PMD18T Vector和HuIFNλ2PMD18T Vector， 分别用SacⅠ、 XhoⅠ和SacⅠ和SalⅠ双酶切鉴定， 均出现610 bp大小的带， 送上海生物工程有限公司测序， 序列与GenBank上报道的序列完全一致（图2）。

　　2.3 PCAGGHuIFNλ1和PCAGGHuIFNλ2真核表达载体的构建及筛选鉴定 将测序正确的HuIFNλ1PMD18T Vector和HuIFNλ2PMD18T Vector质粒分别用SacⅠ、 XhoⅠ和SacⅠ和SalⅠ酶切处理得到目的片段， PCAGG载体用SacⅠ、 Xho Ⅰ酶切处理， 将酶切下片段与处理的载体重组连接并转化至感受态大肠杆菌DH5α， 挑取阳性克隆扩增后双酶切鉴定， 出现610 bp大小的带（图3）。

　　2.4 HuIFNλ1、 HuIFNλ2抗病毒活性测定 用VSV*GFPA549 细胞系测定PCAGGHuIFNλ1和PCAGGHuIFNλ2转染上清的抗病毒活性， 以不同倍数稀释的PCAGGHuIFNλ1和PCAGGHuIFNλ2转染上清分别作用A549 细胞， 感染VSV*GFP， 后荧光显微镜观察。结果显示: 未加病毒的阴性对照组没有荧光(A)， PCAGG空载体转染BHK21细胞的上清处理的细胞孔和BHK21常规培养细胞的上清处理的细胞孔出现大量荧光， VSV*GFPA549在A549 细胞上大量复制(B， C); PCAGGHuIFNλ1 101～104倍稀释时能抑制病毒复制， 105倍稀释时病毒复制与对照组无差异， 104倍稀释孔荧光亮度约为对照组的一半; PCAGGHuIFNλ2 101～103稀释时能抑制病毒复制， 104～105倍稀释时病毒与对照组无差异， 102倍稀释孔荧光亮度约为对照组一半， 所以PCAGGHuIFNλ1活性104 IU/mL， PCAGGHuIFNλ2活性为102 IU/mL（图4）。

　　2.5 HuIFNλ1和HuIFNλ2激活Mx启动子的生物学活性检测结果 10倍稀释的PCAGGHuIFNλ1转染上清处理MDBKMxpLuc细胞系， 参照高亮萤光素酶检测试剂（Promega）说明书检测萤光素酶的表达: 3 h可检测到荧光素酶的表达， 9～12 h达高峰， 15 h开始下降， 24 h消失; 10倍稀释的空质粒转染BHK21的对照上清、 BHK21细胞的阴性培养液处理的MDBKMxpLuc细胞系荧光素酶没有表达（P&<0.05）; PCAGGHuIFNλ2转染上清处理MDBKMxpLuc细胞系萤光素酶的表达: 9～12 h虽达高峰， 且各时段较阴性对照组高， 但无统计学意义（图5）。

　　3 讨论

　　人IFNλs基因位于19号染色体(19q13．13)， 与Ⅰ型干扰素的1个外显子相比， IFNλ1基因有5个外显子， IFNλ2和IFNλ3基因含6个外显子。IFNλ1与IFNλ2的氨基酸同源性为81％， 而IFNλ2与IFNλ3的氨基酸同源性为96％。IFNλ1 和IFNλ2可由滤疱性口腔炎病毒(VSV)刺激人宫颈癌HeLa细胞表达［6］， 本实验中首先由VSV刺激后HeLa细胞中的RNA， 通过RTPCR进行基因克隆， 并实施HuIFNλ1PMD18T Vector和HuIFNλ2PMD18T Vector的双酶切鉴定和测序， 成功地完成了HuIFNλ1和HuIFNλ2质粒的重组; 上述质粒酶切处理得到目的片段与PCAGG载体重组连接后筛选鉴定， 完成了PCAGGHuIFNλ1和PCAGGHuIFNλ2真核表达载体的构建。

　　IFNλ1由含22个氨基酸的信号肽和178个氨基酸的成熟肽组成， 具有2个二硫键和1个潜在的N连接的糖基化位点; IFNλ2和IFNλ3则均由含22个氨基酸的信号肽和174个氨基酸的成熟肽组成， 有3个二硫键， 没有糖基化。IFNλ1与IFNλ2在基因序列上及蛋白结构的差异也决定了其抗病毒活性的不同。本实验PCAGGHuIFNλ1和PCAGGHuIFNλ2在BHK21细胞上获得高效的瞬时表达后， 用VSV*GFPA549 细胞系测定PCAGGHuIFNλ1和PCAGGHuIFNλ2转染上清的抗病毒活性， 以不同倍数稀释的PCAGGHuIFNλ1和PCAGGHuIFNλ2转染上清分别作用A549细胞， 感染VSV*GFP， 后荧光显微镜观察。结果显示IFNλ1的活性约为104 IU/mL， 而IFNλ2的活性约102 IU/mL， IFNλ1的活性明显强于IFNλ2， 约为其100倍， 与Zhou等［7］报道的结果相似。

　　IFNλs诱导抗病毒活性的途径与I型IFN相似， 可通过激活Mx启动子表达MxA抗病毒蛋白和2， 5′OAS(寡腺苷酸合成酶) 而发挥抗病毒作用。鸡Mx启动子序列中的IFN刺激反应元件（interferon stimulated response element， ISRE）与鼠、 人等哺乳动物Mx1或MxA一致， 因此不仅可被鸡的Ⅰ型IFN激活， 而且还对多种哺乳动物Ⅰ型IFN刺激产生转录激活效应［8］， IFNλs家族此信号通路与Ⅰ型IFN一致。本实验结果也证明PCAGGHuIFNλ1和PCAGGHuIFNλ2 转染上清处理MDBKMxpLuc细胞系可以检测到报告基因荧光素酶的表达， 进一步研究HuIFNλ1和HuIFNλ2诱导MxA抗病毒蛋白表达的特点， 其特点是HuIFNλ1诱导MxA抗病毒蛋白3 h即可检测到表达， 9～12 h达高峰， 15 h后减退， 24 h消失; HuIFNλ2诱导MxA抗病毒蛋白表达特点为: 能激活， 但较弱。

　　Ⅰ型干扰素已经用于临床多种疾病（如肿瘤及病毒感染性疾病）的治疗， 但Ⅰ类干扰素的副作用仍不容忽视的， 如病人会出现发热， 食欲不佳， 白细胞减少及血压波动等不良反应， 严重时会引起肾病综合征， 并可继发急性肾功能衰竭， 局部缺血性心脏病、 心肌病等［9］。IFNλs 作为干扰素家族中的新成员， 具有与Ⅰ型干扰素类似的信号转导通路和生物学活性， 目前临床已作为Ⅰ类干扰素的辅助及替代治疗， 且在治疗肝炎方面取得良好的效果［10］。本研究利用体外重组技术构建PCAGGHuIFNλ1和PCAGGHuIFNλ2， 并在BHK21细胞上获得高效的瞬时表达， 在A549细胞上检测到明显的抗病毒活性， 为后续筛选稳定表达的IFNλs细胞株（如肿瘤细胞株）， 进而进行基因治疗和基因重组蛋白药物的研究奠定了基础。

参考文献

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