阿司匹林对人γδT细胞杀伤消化系统肿瘤细胞的影响

　　　　 作者：刘军权， 陈复兴， 朱斌， 张颂 张娟， 陶征中， 李佚

【摘要】 目的: 探讨阿司匹林对人γδT细胞杀伤消化道肿瘤细胞株的影响。方法: 用异戊烯焦磷酸法体外扩增人外周血γδT细胞。用不同浓度的阿司匹林诱导γδT细胞和消化道肿瘤SGC7901、 SW1990、 SW480、 SW1116、 LOVO细胞株， 用乳酸脱氢酶法测定γδT细胞的杀伤活性， 用流式细胞术（FCM）检测阿司匹林诱导前后的γδT细胞和SGC7901、 SW1990、 SW480、 SW1116和LOVO细胞凋亡百分率。结果: γδT细胞培养10 d时从扩增前4.21%增加到70.35%。阿司匹林0.4～0.8 mmol/L诱导24 h后的γδT细胞对5种肿瘤细胞的杀伤活性最高， 浓度超过3.2 mmol/L时杀伤活性呈下降趋势; SGC7901、 SW1990、 SW480、 SW1116和LOVO细胞经不同浓度的阿司匹林诱导24 h后除药物浓度在0.4 mmol/L时γδT细胞对SW480、 SW1116和LOVO细胞株的杀伤活性略有增强外， 其他组与对照组比较无明显变化。3.2 mmol/L阿司匹林对γδT细胞诱导24 h的凋亡率（52.71%）明显高于SGC7901、 SW1990、 SW480、 SW1116和LOVO细胞株(分别为7.88%、 8.89%、 6.21%、 4.47%和%3.67)。结论: 阿司匹林在临床常规使用的药物浓度时可增强γδT细胞杀伤肿瘤细胞作用， 超过这一浓度可明显抑制γδT细胞的增殖能力和杀伤活性及增加γδT细胞的凋亡率， 而对SGC7901、 SW1990、 SW480、 SW1116和LOVO细胞株作用不明显。

【关键词】 γδT细胞; 阿司匹林; 消化系统肿瘤细胞株

　　［Abstract］ AIM: To explore the effect of aspirin on human’s γδT cells killing digestive system tumor cell lines. METHODS: Use the isopentenyl pyrophosphate method to amplify human peripheral blood γδT cells in vitro. Various concentrations of aspirin were used to induce γδT cells and digestive system tumor cells SGC7901， SW1990， SW480， SW1116， LOVO cells lines， LDH assays was used to measure the cytotoxic activity of γδT cells，　　 flow cytometry analysis the apoptosis percentage of before and after induced γδT cells and SGC7901， SW1990， SW480， SW1116， LOVO cell lines. RESULTS: γδT cells were cultivated for ten days which proliferation ratio increase from 4.21% to 70.35%. When γδT cells induced via aspirin concentrations rang from 0.4 mmol/L to 0.8 mmol/L which cytotoxic activity on the five kinds of tumor cell lines was the highest， if aspirin’s concentration surpassing 3.2 mmol/L， cytotoxic activity of γδT cells present decrease tendency. SGC7901， SW1990， SW480， SW1116， LOVO cells lines were induced by different　　 concentrations of aspirin for 24 hours， just SW480， SW1116 and LOVO were enhanced as far as the cytotoxic activity of γδT cells on these cell lines was concerned， other groups and control group have no notable changed. The apoptosis percentage of γδT cells(52.71%) were induced by aspirin which concentration was 3.2 mmol/L， which was strikingly higher than SGC7901， SW1990， SW480， SW1116， LOVO cells lines， (respectively 7.88%，　　 8.89%， 6.21%， 4.47% and 3.67%). CONCLUSION: When aspirin’s concentration for clinical routine used can enhance the effect of γδT cells killing the tumor cells， if surpassing this concentration can obvious inhibited the proliferation capacity and cytotoxic activity of γδT cells and augment apoptosis ratio， however， it is not obvious for digestive tract tumor lines.

　　［Keywords］γδT cells; Aspirin; digestive system tumor cell lines

　　［摘 要］ 目的: 探讨阿司匹林对人γδT细胞杀伤消化道肿瘤细胞株的影响。方法: 用异戊烯焦磷酸法体外扩增人外周血γδT细胞。用不同浓度的阿司匹林诱导γδT细胞和消化道肿瘤SGC7901、 SW1990、 SW480、 SW1116、 LOVO细胞株， 用乳酸脱氢酶法测定γδT细胞的杀伤活性， 用流式细胞术（FCM）检测阿司匹林诱导前后的γδT细胞和SGC7901、 SW1990、 SW480、 SW1116和LOVO细胞凋亡百分率。结果: γδT细胞培养10 d时从扩增前4.21%增加到70.35%。阿司匹林0.4～0.8 mmol/L诱导24 h后的γδT细胞对5种肿瘤细胞的杀伤活性最高， 浓度超过3.2 mmol/L时杀伤活性呈下降趋势; SGC7901、 SW1990、 SW480、 SW1116和LOVO细胞经不同浓度的阿司匹林诱导24 h后除药物浓度在0.4 mmol/L时γδT细胞对SW480、 SW1116和LOVO细胞株的杀伤活性略有增强外， 其他组与对照组比较无明显变化。3.2 mmol/L阿司匹林对γδT细胞诱导24 h的凋亡率（52.71%）明显高于SGC7901、 SW1990、 SW480、 SW1116和LOVO细胞株(分别为7.88%、 8.89%、 6.21%、 4.47%和%3.67)。结论: 阿司匹林在临床常规使用的药物浓度时可增强γδT细胞杀伤肿瘤细胞作用， 超过这一浓度可明显抑制γδT细胞的增殖能力和杀伤活性及增加γδT细胞的凋亡率， 而对SGC7901、 SW1990、 SW480、 SW1116和LOVO细胞株作用不明显。

　　［关键词］γδT细胞; 阿司匹林; 消化系统肿瘤细胞株

　　γδT细胞是广泛分布于消化系统、 呼吸系统等黏膜和上皮组织内的固有免疫T细胞， 它的抗肿瘤效应除了有与αβT细胞类似的一些功能特征外， 还有识别抗原不需要MHC分子提呈、 直接识别蛋白质和肽类抗原、 非肽类抗原， 具有抗原提呈功能和能通过细胞接触和分泌的细胞因子起免疫调节作用［1］。流行病学调查发现， 长期服用非甾体类抗炎药能减少和预防消化道肿瘤的发生［2］， 阿司匹林是非甾体抗炎药物的代表。为此， 本研究用不同浓度的阿司匹林对人γδT细胞和5株消化系统肿瘤细胞株进行γδT细胞杀伤活性和细胞凋亡的对比试验， 以探讨阿司匹林对人γδT细胞杀伤肿瘤细胞的影响。

1 材料和方法

　　1.1 材料 人胃腺癌细胞株SGC7901、 人胰腺癌细胞株SW1990、 人结肠癌细胞株SW480、 SW1116和LOVO购自上海细胞生物研究所; 胰蛋白酶、 RPMI1640为Gibco公司产品; 人AB血清徐州市血站提供; 胎牛血清和淋巴细胞分离液购自中国科学院血液病研究所; 异戊烯焦磷酸(isopentenylpgrophosphate， IPP)、 阿司匹林、 PI染液购自Sigma公司; IL2购自厦门特宝生物公司; 乳酸脱氢酶试剂盒购于日本世诺临床诊断制品株式会社; 抗人TCRγδFITC和抗人CD44FITC均购自杭州联科生物公司; SEAC全自动酶免系列分析仪购自北京希亚克技术有限公司; 流式细胞仪购自BD公司， 并利用CellQuest软件进行参数获取和数据分析（每个标本分析细胞数≥1×104）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 γδT细胞的培养和鉴定 按文献［3］进行， 取健康献血者末梢抗凝血10 mL， 加入淋巴细胞分离液上， 以2 000 r/min， 离心15 min， 吸取单个核细胞层， 用生理盐水洗涤3遍（1 500 r/min离心， 10 min/次）， 加入RPMI1640培养液中（含IL2 2×105 U/L、 100 mL/L小牛血清、 50 mL/L人AB血清和IPP 3 mg/L）， 调整细胞密度为1×108/L， 置75 cm2细胞培养瓶中， 于37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养， 根据细胞生长情况及时添加培养液。收集培养10 d的贴壁生长细胞进行细胞表面标志检测和其他实验。

　　1.2.2 γδT细胞和消化系统肿瘤细胞株凋亡检测 分别取培养10 d的γδT细胞和对数生长期SGC7901、 SW1990、 SW480、 SW1116和LOVO细胞以每孔2×105个细胞接种于24孔板， 用阿司匹林(终浓度分别为0.2、 0.8、 3.2、 12.8和25.6 mmol/L)诱导， 每组设3个复孔。细胞经药物诱导24 h后弃上清， SGC7901、 SW1990、 SW480、 SW1116和LOVO细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化后收集细胞， γδT细胞直接收集， 用RPMI1640培养液洗涤3遍， 加入700 mL/L冷乙醇固定， 4℃过夜。PBS洗涤3次， 加入PI染液(生理盐水129.6 mL， PI 10 mg， RNA酶2 mg， TritonX100 1 mL， 枸橼酸钠200 mg， 加双蒸水至200 mL)， 4℃避光染色30 min， 用FCM检测， 记录激发波长488 nm处的红色荧光。

　　1.2.3 γδT细胞杀伤活性检测 分别取培养10 d的γδT细胞和对数生长期SGC7901、 SW1990、 SW480、 SW1116和LOVO细胞配成2×108/L， 加入6孔细胞培养板中， 每孔3 mL， 培养24 h后加入不同浓度的阿司匹林， 同时设未加药的对照组， 继续孵育24 h后， SGC7901、 SW1990、 SW480、 SW1116和LOVO细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化后收集细胞和直接收集γδT细胞， 用RPMI1640培养液洗涤3遍， 将效应细胞γδT细胞配成2×109/L的悬液， 靶细胞SGC7901、 SW1990、 SW480、 SW1116和LOVO细胞配成2×108/L， 用乳酸脱氢酶试剂盒［4］测定γδT细胞杀伤活性， 将效靶细胞数按10∶1比例混合， 以500 r/min， 离心5 min， 置37℃、 50 mL/L CO2孵箱中孵育6 h后， 轻轻混匀细胞， 再以1 500 r/min，　　 离心10 min。收集上清液在全自动生化分析仪（Olympus AU1000）用乳酸脱氢酶试剂盒测定A340值， 并计算乳酸脱氢酶活力单位（LD单位）。

　　杀伤活率=（实验组LD单位-效应细胞自然释放组LD单位）/（靶细胞最大释放组LD单位-靶细胞自然释放组LD单位）×100%

　　1.2.4 统计学分析 采用SPSS10.0软件进行数据处理， 数据以x±s表示。组间比较采用独立样本t检验。

2 结果

　　2.1 γδT细胞培养和形态学观察及纯度鉴定 PBMC在γδT细胞培养液中培养24 h即可见贴壁生长， 48 h后集落开始变大， 培养10 d可见大的集落和单个贴壁生长细胞。收集培养前后贴壁生长的细胞进行mAb荧光标记后行流式细胞术检测并分析。培养前γδT细胞数为4.21%; 培养10 d时γδT细胞数为70.35%。

　　2.2 不同浓度阿司匹林诱导后的γδT细胞和5种肿瘤细胞株的凋亡率 结果显示， 阿司匹林浓度≤0.4 mmol/L作用24 h时均不能明显致γδT细胞或肿瘤细胞凋亡， 在0.8 mmol/L时对γδT细胞的凋亡率为9.31%， 而对肿瘤细胞株没有明显作用。当阿司匹林浓度达3.2 mmol/L时对部分肿瘤细胞才有一定的促凋亡作用， 而此时γδT细胞的凋亡率已经达到52.71%。从表1中可以看出， 虽然阿司匹林促5株肿瘤细胞凋亡作用不相同， 但是同一浓度致γδT细胞的凋亡率明显高于肿瘤细胞株。结果见表1和图1。表1 不同浓度的阿司匹林对γδT细胞和5株消化系统肿瘤细胞株凋亡的影响 aP&<0.05 vs the tumor cells which were treated with a sane drug concentration; cP&<0.05 vs the same cell’s control group.图1 阿司匹林在3.2 mmol/L时诱导的γδT细胞和5种消化系统肿瘤细胞株凋亡图

　　2.3 经阿司匹林处理后的效靶细胞杀伤活性检测 γδT细胞经0.4～0.8 mmol/L的阿司匹林诱导24 h后对5种肿瘤细胞的杀伤活性明显高于对照组; 其中经0.4 mmol/L阿司匹林诱导的γδT细胞对SGC7901、 SW1990、 SW480、 SW1116和LOVO细胞杀伤活性（分别为59%、 63%、 73%、 65%和71%）明显高于对照组（分别为54%、 52%、 53%、 47%和60%）(P&<0.05)， 当浓度超过3.2 mmol/L时对全部肿瘤细胞的杀伤活性均低于对照组。SGC7901、 SW1990、 SW480、 SW1116和LOVO细胞经不同浓度的阿司匹林诱导24 h后γδT细胞对其的杀伤活性除浓度在0.4 mmol/L时对SW480、 LOVO和SW1116的杀伤活性（分别为66%、 67%和76.1%）明显高于对照组(分别为56%、 57%和56%)外， 其他组与对照组比较均无明显变化。

3 讨论

　　西方流行病学调查发现， 使用非甾体类抗炎药治疗类风湿关节炎患者的结肠癌发病率下降40%～60%［2］。阿司匹林为非甾体抗炎药物的代表， 长期用于治疗风湿、 类风湿疾病， 近十余年的研究表明， 常规服用可降低消化系统恶性肿瘤的发生率和死亡率。Piqué等［5］发现， 阿司匹林诱导不同细胞凋亡时， 凋亡细胞线粒体中caspase3， caspase8和caspase9的活性增加， 提示阿司匹林诱导的细胞凋亡与caspase有关， 但引发半胱天冬酶增加的机制尚未明确， 有可能与细胞色素C的活性增加有关。随机试验已发现阿司匹林和环氧合酶2（COX2）抑制剂可以降低40%有腺瘤或结肠直肠癌病史患者的复发［6］。一些研究认为， 阿司匹林主要通过抑制COX2的活性以降低前列腺素2的合成发挥作用。COX2是催化花生四烯酸转化为前列腺素合成过程中的一个关键限速酶。已知前列腺素除可参与维持机体正常的生理机能， 如保护胃黏膜细胞， 调节肾脏血流和控制血小板聚集等作用外， 还可通过抑制抗肿瘤免疫反应而有利于肿瘤细胞的生长， 或通过抑制巨噬细胞、 T杀伤细胞、 自然杀伤细胞活性以及肿瘤坏死因子、 γ干拢素、 IL1、 IL2等淋巴因子的产生等多种途径促进肿瘤的发生和发展［7］。然而， 许多实验结果显示［2， 8， 9］， 阿司匹林体外诱导肿瘤细胞株凋亡或死亡实验所需的药物剂量是临床常规实际使用量的数倍， 这些实验结果提供的数据明显脱离了实际临床应用事实。因此， 我们选用不同浓度的阿司匹林在体外对人γδT细胞和肿瘤SGC7901、 SW1990、 SW480、 SW1116和LOVO细胞株进行诱导试验。

　　γδT细胞是存在于消化系统等上皮内的固有免疫T细胞， 主要通过识别非肽类抗原和通过NKG2D识别表达在肿瘤细胞表面的MICA/B、 uLBPs和F1ATP合酶等配体来识别肿瘤细胞， 然后通过释放穿孔素、 颗粒酶及Fas/FasL途径杀伤肿瘤细胞。一些研究发现， 许多消化道肿瘤细胞表面表达MICA、 MICB、 uLBP蛋白和产生γδ TCR刺激物如IPP， 表达ICAM1， 这为γδT细胞与这些肿瘤的结合和激活直至杀伤提供基础［10， 11］。经阿斯匹林诱导后的γδT细胞能明显提高对5种肿瘤细胞的杀伤活性， 可能是诱导后的γδT细胞NKG2D受体表达增加及这些肿瘤细胞产生IPP和高表达NKG2D配体、 ICAM等有关。我们研究结果显示， 阿司匹林提高人γδT细胞杀伤肿瘤细胞活性有浓度窗现象， 当浓度过高时会导致γδT细胞凋亡反而减低其杀伤活性; 阿司匹林诱导γδT细胞和肿瘤细胞凋亡也存在明显的差异， 阿司匹林在0.8 mmol/L时即可导致γδT细胞凋亡， 而对肿瘤细胞株需达到3.2 mmol/L以上时才有上述作用。这一结果与Paolo报道的阿司匹林浓度加到3 mmol/L时还不能明显抑制大肠癌细胞的增殖和提高凋亡率相一致。表明， 常规的非甾类药物使用量能预防消化道肿瘤的发生可能与黏膜层中的γδT细胞有关［12］， 而不是对肿瘤细胞的直接作用。我们实验中还发现， γδT细胞能明显提高对经一定浓度阿司匹林诱导的结肠癌SW480、 SW1116和LOVO细胞株的杀伤活性， 对胃腺癌SGC7901和胰腺癌SW1990细胞株作用不明显， 是否进一步提示， 阿司匹林对结直肠肿瘤的预防作用明显好于其他消化道肿瘤可能与γδT细胞有关。以上结果也为临床阿司匹林预防消化道肿瘤的用量提供了实验依据。

　　阿司匹林诱导的γδT细胞能提高其杀伤活性是否为阿司匹林促进γδT细胞高表达NKG2D和ICAM1有关有待进一步研究; 经阿司匹林诱导后的SW480、 SW1116和LOVO细胞是否使其DNA损伤、 DNA修复酶抑制、 VEGF表达增加和caspases酶活性受抑制等［13］及NKG2D配体表达增加是其更利于γδT细胞识别和杀伤有关有待进一步研究。

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