抗人LPGDS人鼠嵌合轻链的真核表达

　　　　 作者：黄连春， 包国强， 曹永安

【摘要】 目的: 在Sp2/0细胞中表达抗人LPGDS人鼠嵌合轻链。方法: 采用RTPCR技术从稳定分泌抗人LPGDS单克隆抗体(mAb)的小鼠杂交瘤细胞中扩增抗体轻链可变区基因VL， 并构建到人鼠嵌合轻链表达载体pAG4622。重组质粒pAG4622/VL经DOTAP试剂转染入Sp2/0细胞， 酶酚酸筛选后用ELISA和RTPCR检测表达产物。结果: 在筛选后的转染细胞上清中检测到抗人LPGDS人鼠嵌合轻链蛋白， 且其细胞中存在相应嵌合轻链mRNA。结论: 嵌合轻链的稳定表达， 为后续抗人LPGDS人鼠嵌合抗体的获得奠定基础。

【关键词】 LPGDS; 人鼠嵌合轻链; 表达

　　Lipocalin型前列腺素D合成酶（Lipocalintype prostaglandin D synthase， LPGDS， EC5.3.99.2）是一种双功能糖基化单体蛋白， 除可转运一些亲脂性物质， 还能催化PGD2的合成［1］。LPGDS 与许多疾病密切相关， 如 LPGDS 不同程度地表达于卵巢癌、 乳腺癌等组织［2］， 病毒性脑膜炎、 脑脊膜瘤、 椎管狭窄、 脑栓塞等患者的 CSF 中LPGDS 呈明显偏高［3］。另外， 肥大细胞贮积病和非洲昏睡病患者的深度昏迷被认为是由于内源性PGD2产量明显增加所致， 而PGD2的增加与LPGDS增高有关［4］。因此， 抗人LPGDS抗体有可能应用于人体治疗上述疾病， 同时亦可用于体外诊断。虽然兔抗人 LPGDS 多抗和鼠抗人 LPGDS 单克隆抗体（mAb）已被报道［5］， 但特异性鼠mAb具有异源性， 应用于人体研究会引发人抗鼠抗体的毒性反应等。本研究中， 我们利用基因工程技术构建表达抗人LPGDS人鼠嵌合轻链。

1 材料和方法

　　1.1 材料 抗人LPGDS mAb鼠杂交瘤细胞株和嵌合轻链表达载体pAG4622购自南京军区总医院检验医学研究所， Sp2/0细胞购自南医大分子实验室， DOTAP转染试剂购自 Roche公司， TRIzol试剂为Promega公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 mAb轻链可变区基因的克隆 合成一组自抗体前导序列和VC 交界处的简并引物， 从1株稳定分泌抗人 LPGDS mAb的鼠杂交瘤细胞中扩增抗体轻链可变区基因VL。PCR产物经琼脂糖电泳分离纯化回收后， 克隆入pGEMT并转化E.coli JM109。将经PCR和双酶切鉴定出的阳性克隆送上海博亚公司测序， 并登录Kabat Ig基因数据库对所测定的序列进行网上比对分析。

　　1.2.2 人鼠嵌合轻链真核表达载体的构建 用EcoR V、 Sal I先后双酶切pGEMT/VL和含有人抗体相应恒定区序列的真核表达载体pAG4622， 经T4连接酶构建成抗人LPGDS人鼠嵌合轻链表达载体pAG4622/VL。重组载体转化HB101， 抗性筛选后经PCR和双酶切共同鉴定。

　　1.2.3 重组表达载体的Sp2/0细胞转染及筛选 DOTAP转染法（参照Roche产品说明）: 取纯化后的重组载体DNA 5 μg溶解于50 μL HBS， 与含有30 μL DOTAP的100 μL HBS稀释液轻轻混合， 15～25℃孵育10～15 min后加入1 mL无血清培养液DEME， 再次轻轻混匀后立即逐滴加入已处理好的1.5×106个Sp2/0细胞（于4 mL无血清DEME液中）。转染后的细胞37℃、 50 mL/L CO2孵育6 h后换成含100 mL/L胎牛血清的DEME培养液， 48 h后再换成含1 mg/L酶酚酸的选择培养液进行培养。同时传代并进行克隆化培养。

　　1.2.4 人鼠嵌合轻链的ELISA检测 将羊抗人IgG Fab(Sigma公司)包被ELISA板， 经10 g/L BSA封闭后加入待测培养上清及对照(阴性对照: 未转染的Sp2/0细胞培养上清; 阳性对照: 本室纯化并保存的人IgG)。孵育洗涤后， 以HRP 标记的羊抗人IgG Fab(Sigma公司)进行结合反应。以OPD底物显色， 测A490值。

　　1.2.5 人鼠嵌合轻链的RTPCR检测 用TRIzol试剂从稳定分泌表达嵌合轻链蛋白的细胞克隆中提取总RNA， 反转录成cDNA后以下列引物PCR扩增抗人LPGDS人鼠嵌合轻链的mRNA。其可变区基因的5′引物(起始于信号肽序列): VL: GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG（含EcoR V酶切位点）; 人抗体κ轻链的3′引物: Cκ: GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTCATTTCCAGCTT（含Sal I酶切位点）。

2 结果

　　2.1 mAb轻链可变区基因的克隆 克隆得到的VL基因全长345 bp， 在其上、 下游分别存在57 bp的前导肽序列和24 bp J基因区。VL基因内无终止码， 为一开放阅读框， 共编码115个氨基酸（图1）。序列中有明确的4个框架区（FRs）和3个互补决定区（CDRs）， 其中第23、 93位氨基酸为抗体可变区特征性Cys， 表明VL的氨基酸序列符合鼠抗体可变区特征。经Igblast比对分析， 与VL同源性较高的序列是编码鼠 IgΚ轻链基因。图1 扩增出的抗人LPGDS mAb轻链可变区基因（划线处为CDR区）

　　2.2 人鼠嵌合轻链真核表达载体的构建 人鼠嵌合轻链基因的构建见图2， 经抗性筛选、 PCR、 双酶切鉴定获得含嵌合轻链基因的重组表达载体pAG4622/VL。

　　图2 重组表达载体pAG4622/VL的构建示意图

　　2.3 人鼠嵌合轻链在Sp2/0细胞中的表达及ELISA检测 将构建好的重组载体pAG4622/VL用DOTAP转染至小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0细胞， 经酶酚酸选择性培养2～3周， 获得2株阳性克隆。每一克隆经扩大培养后， 取其培养上清， 并用饱和(NH4)2SO4浓缩50倍后进行ELISA检测， 结果A490分别为1.320±0.008和1.531±0.021， 而阴性对照（未转染的Sp2/0）和阳性对照（人IgG）的A490分别为0.041±0.010和1.720±0.005， 表明转染、 筛选后的Sp2/0细胞培养上清中含有人κ链蛋白， 同时因信号序列位于鼠VL N端， 证明所克隆的抗人LPGDS mAb轻链可变区基因具有表达活性。

　　2.4 人鼠嵌合轻链的RTPCR检测 为进一步证实筛选出的细胞克隆表达抗人LPGDS人鼠嵌合轻链， 用RTPCR方法检测其mRNA的存在， 结果见图3。

　　图3 RTPCR 扩增抗人LPGDS人鼠嵌合轻链mRNA

　　1: 鼠轻链可变区5′引物和人κ链恒定区3′引物扩增出的650 bp左右嵌合轻链基因; 2: 从转染筛选后的细胞克隆中扩增出的抗人LPGDS mAb轻链可变区基因VL; 3: 未转染的Sp2/0对照; M: DNA marker.

3 讨论

　　近年研究表明， LPGDS为Lipocalin家族中的一员， 在雄性生殖系统中的主要作用可能是结合肾上腺素、 类固醇、 维生素A等物质， 携带它们越过血睾屏障， 来协助精子细胞的发育和附睾中精子的成熟［1］。另外， 对人精浆中LPGDS的研究显示［6］， 正常组、 少精子症组、 无精子症组及精管切除组的精浆LPGDS依次降低， 其浓度与精子密度、 活率及正常形态百分率呈正相关。提示， LPGDS可能与精子发生和男性生育密切相关， 但LPGDS在男性生殖系统中的具体作用及作用机制至今仍然不很清楚。

　　鼠mAb作为异源性蛋白质在人体内可诱发抗鼠抗体的毒性反应（HAMA）， 并使mAb在体内消除加快， 严重影响鼠mAb的基础研究及临床应用。但抗体的恒定区是抗体分子结构中免疫原性最强的部位， 而决定抗体特异性的是抗体可变区， 因此通过基因工程手段将鼠mAb的恒定区置换为人源化抗体的恒定区可大大降低抗体在人体中的HAMA反应。这种人鼠嵌合抗体既具有鼠源mAb的特异性抗原结合能力， 又具有人源抗体的免疫介导功能。我们选用含有人Cκ序列的嵌合轻链表达载体pAG4622， 该载体的优点是利用限制性酶切位点可直接拼接RTPCR克隆的鼠mAb VL， 使构建嵌合抗体的过程较为简便; 同时克隆鼠mAb VL时是从前导序列设计5′端引物， 保证了可变区成熟蛋白氨基酸序列的忠实性。用DOTAP等方法将外源DNA转染入真核细胞， 在穿过细胞质进入细胞核的过程中， 大部分外源DNA被内源性DNA酶降解。只有极少数外源DNA可整合入细胞染色体中获得稳定表达， 因而转染的细胞克隆形成率一般很低; 而且由于DNA整合位点及拷贝数的不同， 外源性蛋白的转录、 翻译效率将不同， 所以不同细胞克隆的蛋白表达量会有所不同。总之， 抗人LPGDS人鼠嵌合轻链的稳定表达， 为后续抗人 LPGDS人鼠嵌合抗体的获得、 LPGDS的基础研究及临床应用奠定了基础。

参考文献

［1］ 陈德宇， 黄宇烽， 周开亚. Lipocalin型前列腺素D合成酶的结构、 定位与特性［J］. 中华男科学， 2004， 10（2）: 134-138.

［2］ Su B， Guan M， Zhao R， et al. Expression of prostaglandin D synthase in ovarian cancer［J］. Clin Chem Lab Med， 2001， 39（12）: 1198-1203.

［3］ Hiraoka A， Arato T， Tominaga I， et al. Capillary electrophoretic analysis of betatrace protein and other low molecular weight proteins in cerebrospinal fluid from patients with central nervous system diseases［J］. J Pharm Biomed Anal， 1997， 15(9-10): 1257-1263.

［4］ 陆金春， 张红烨. 前列腺素D2与睡眠调节［J］. 生命科学， 2002， 14（3）: 176-179.

［5］ 高 云， 黄宇锋， 夏欣一， 等. 人睾丸前列腺素D合成酶在毕赤氏酵母中的表达纯化及鉴定［J］. 中国生物化学与分子生物学报， 2003， 19（6）: 757-762.

［6］ Leone MG， Abdel HH， Gennaro G， et al. Changes of Lipocalin type prostaglandin Dsynthase in the seminal plasma of subfertile man［J］. Res Commun Mol Pathol Pharmacol， 2001， 110(1-2): 17-25.