一种基于免疫印迹的高通量肿瘤相关抗原筛选和鉴定方法

　　　　 作者：李江伟， 苏幼红， 杨薇薇， 晏鹏飞， 赵银霞

【摘要】 目的: 为了分析SEREX抗原克隆在异体食管癌患者血清中和健康对照人血清中的反应情况， 我们发展了一种基于免疫印迹的高通量肿瘤相关抗原筛选和鉴定方法。方法: 采用新发展的基于免疫印迹原理的抗原克隆微阵列检测方法与传统的噬菌斑检测法对食管癌患者血清中IgG的反应情况进行了比较， 并采用两种方法分析了两个SEREX阳性克隆与40例食管癌患者血清和40例健康人血清中的IgG的阳性反应率。通过ELISA对两种方法得到的结果进行了验证。结果: 两个阳性克隆在两种检测方法中均与同一例食管癌病人血清起反应， 采用抗原克隆微阵列检测方法检测p53和rps3两个克隆阳性率分别为25%和37.5%， 采用噬菌斑检测法检测p53和rps3两个克隆阳性率分别为27.5%和 37.5%; ELISA方法检测p53和rps3两个克隆阳性率分别为25.0%和31.25%。结论: 本研究采用两种方法检测患者血清IgG反应的结果是一致的， 抗原克隆微阵列检测方法可以代替传统的噬菌斑筛选法。

【关键词】 抗原克隆微阵列检测方法; 噬菌斑筛选法; ELISA; 体液免疫; SEREX抗原

　　近年来， 随着基因组学和蛋白质组学研究手段在肿瘤免疫学中的应用， 一些高通量鉴定和分离肿瘤相关抗原的方法相继建立并应用， 尤其是Pfreundschuh 和Sahin等［1］发展的采用自体患者血清分析肿瘤细胞重组噬菌体 cDNA 表达文库的方法， 即SEREX（serological analysis of recombinant cDNA expression libraries）技术， 是一种强有力的筛选分离肿瘤相关抗原的手段。该技术已被广泛应用于多种肿瘤， 鉴定得到了多达上千个肿瘤相关的自身抗原［2］。这些众多的由肿瘤自身抗原诱导机体产生的抗体分子为我们从体液免疫角度分析肿瘤和宿主免疫之间的联系提供了新的手段。

　　采用自体或异体患者血清筛选肿瘤组织cDNA文库获得的大量噬菌体阳性克隆还需要进一步分析其与肿瘤的相关性， 其中最重要的方面就是分析这些阳性克隆在异体患者血清中和健康对照人血清中的反应情况， 从而确定其作为肿瘤免疫治疗的候选抗原或作为诊断的标志物的价值。常规分析这些抗原克隆体液免疫反应的方法主要是plaque assay法和ELISA方法［3］。其中plaque assay法需要较多量的血清， 在一张转印膜上只能检测一个克隆， 并且操作费时费力。而ELISA方法虽然具有操作简单和敏感性高以及一次可检测多个抗原的优点， 但需要获得纯化的抗原， 限制了其在分析SEREX抗原体液免疫反应中的应用。最近， 我们在采用SEREX方法筛选食管癌cDNA表达文库时［4］， 采用了一种新的基于免疫印迹的检测体液免疫的方法， 可以不需要纯化的抗原， 一次可以分析大量抗原克隆， 具有高通量和操作简便等优点， 可以用于对SEREX筛选获得的抗原克隆进行初步的肿瘤体液免疫反应分析。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 用于检测SEREX抗原克隆抗体反应的40例食管癌患者血清和40例健康人血清均来自中国医学科学院肿瘤医院， 血清采集后保存于-80℃， 冻融不超过2次。血清使用前用偶联了大肠杆菌/噬菌体裂解液的Sepharose4B凝胶柱进行了吸收， 收集吸收后的血清， 用含有10 g/L BSA的1×TBS以最终1∶100（血清∶缓冲液， 体积比）的稀释度稀释血清， 加入0. 2 g/L的叠氮钠防腐， 4℃保存备用。用于分析的食管癌SEREX抗原， 由本实验室对食管癌cDNA文库进行SEREX筛选时获得。为含相应抗原基因片段的噬菌体。在加入IPTG诱导剂时， 其中融合的抗原基因片段可以表达相应的抗原蛋白。

　　1.2 方法

　　1.2.1 常规噬菌斑检测法（plaque assay） 将SEREX筛选最终获得的阳性重组克隆噬菌体与没有插入片段的空载噬菌体以等比例混合后， 共同铺于预先感染XL1BlueMRF宿主菌的NZY琼脂培养基平板上， 待噬菌斑刚开始长出时， 转印至经10 mmol/L IPTG浸泡的硝酸纤维素膜上37℃诱导表达8 h后， 将硝酸纤维素膜经过洗涤、 封闭后与血清室温反应1 h， 然后与1∶10 000 稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG (Sigma公司) 室温孵育1 h。经过洗涤后与NBT/BCIP底物液反应， 暗室中显色。阳性克隆与空载噬菌体噬斑的显色反应有明显差异者判断为阳性。

　　1.2.2 基于免疫印迹的抗原克隆微阵列检测方法 按照0.5 μL/点（相当于500 pfu）将各阳性克隆噬菌体及空载对照噬菌体点于事先制备好的含有5 mmol/L IPTG及8 g/L琼脂糖的LB琼脂平板上， 37℃倒置扩增过夜。然后转印至硝酸纤维素膜上37℃诱导表达4～5 h。将平板移至4℃， 放置2 h。揭掉硝酸纤维素膜后， 于TBST缓冲液中洗涤5次， 用10 g/L BSA/TBS 4℃封闭过夜。然后与吸收后的血清室温反应1 h。用TBST洗涤5次后， 分别与1∶2 500 稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgM及1∶10 000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG二抗室温孵育1 h。用TBST洗涤5次， 最后1次换用TBS， 加入至配制好的NBT/BCIP底物液中， 暗室内显色。

　　1.2.3 ELISA 法检测 p53和RPS3两抗原采用RTPCR克隆其全长编码序列， 构建到pET30b（+）载体上， 并在Bl21 E.coli中进行表达。抗原蛋白的纯化按照NiNTA HisBind Resins（Novagen）蛋白纯化说明书进行。SDSPAGE电泳及Western blot鉴定复性后蛋白的纯度。随后以包被液将纯化的重组抗原稀释到1 mg/L， 在96孔酶标板中以50 μL/孔包被抗原， 4℃过夜。次日， 经过含0.5 mL/L Tween 20的PBS洗板后， 以含10 g/L BSA的PBS封闭过夜。弃封闭液后， 每孔加入100 μL稀释至1∶100的血清， 37℃反应2 h， 洗涤后， 加入过氧化物酶偶联的鼠抗人IgG抗体(Sigma公司)， 37℃反应2 h。经过含0.5 mL/L Tween20 的PBS充分洗涤后， 加入TMB显色底物， 37℃显色30 min。显色完成后加入硫酸中止反应， 在酶标仪上测定各孔A450 nm的吸收值。以A450 nm＞正常血清A450 nm平均值+2SD 判断为阳性反应 ［5］。

　　2 结果

　　2.1 基于免疫印迹的抗原克隆微阵列检测方法与常规噬菌斑检测法的比较 采用两种方法分别对20个抗原克隆进行了检测， 结果见图1， 其中显示的是两个代表性的阳性克隆ESC9和ESC22（这两个克隆在随后的鉴定中确定为p53和RPS3）与1例食管癌血清的反应情况。从图中可以看出， 两个阳性克隆在两种检测方法中均与同一例食管癌患者血清起反应， 表明采用两种方法检测的结果是一致的， 说明采用抗原克隆微阵列检测方法是可行的， 可以替代费时费力的噬菌斑筛选法。

　　图1 常规噬菌斑检测法(A) 和微阵列检测方法（B、 C）对异体血清检测的比较

　　1-4: 分别是4个抗原克隆与同1例血清的反应情况; 5: 空载对照文库噬菌体; C: 20个抗原克隆与1例食管癌患者血清的反应情况， 图中两个SEREX抗原ESC9（C图上部）和ESC22（C图下部）显示阳性反应， 最下一排是空载对照文库噬菌体.2.2 采用两种方法检测ESC9和ESC22与食管癌患者血清的反应情况 在以上结果的基础上， 采用抗原克隆微阵列方法与常规噬菌斑法分别检测了ESC9和ESC22两个抗原噬菌体克隆与40例食管癌患者和40例健康人血清的阳性反应率(表1)。从中可以看出， 采用两种方法得到的结果基本一致。常规噬菌斑法检测的敏感性略高于抗原克隆微阵列方法。表1 抗原克隆微阵列方法与常规噬菌斑法检测40例食管癌患者血清的IgG抗体反应阳性率比较

　　2.3 ELISA对2种抗原的血清反应 采用间接ELISA方法对40例食管癌患者和40例健康人血清中的IgG抗体进行了检测， 以此验证采用前述两种方法检测结果的可靠性。在ELISA中， 采用健康人血清来确定阳性反应的cutoff值。其中， p53在健康人血清ELISA检测中的A450值为0.46±0.19， 根据阳性反应判定公式， 其cutoff值=0.46+2×0.19=0.84， 同样， RPS3在健康人血清ELISA检测中的A450值为0.33±0.15， 其cutoff值为0.63。

　　采用以上确定的阳性判断标准对食管癌患者和健康人血清进行了检测和分析， 结果各抗原血清反应的阳性率和抗体反应的A450均值见表2。表明， SEREX结果与噬斑法及微阵列法检测得到的结果是一致的。表2 ELISA检测两种SEREX抗原在40例食管癌患者和健康人血清的IgG抗体阳性率

　　3 讨论

　　目前采用SEREX方法已鉴定了2 169个诱导IgG抗体产生的肿瘤自身抗原［4， 6］(截止2004年2月）， 几乎涵盖了各种肿瘤类型。尽管SEREX已被证明是一个强有力的鉴定肿瘤相关自身抗原的方法， 然而传统的筛选策略是对自体患者进行分析， 这就有可能导致获得的许多SEREX抗原仅仅只与供体患者血清反应而不与同种肿瘤的其他个体血清反应， 这样的抗原无论是对基于群体的早期筛查还是作为免疫治疗的靶位都没有太大价值。而且当前基于自身抗体的肿瘤抗原筛选策略存在一个重要的问题， 这就是由此获得的抗原需要进一步确定其与肿瘤的相关性， 即确定哪些抗原是真正肿瘤相关， 哪些只是机体其他疾病免疫状态的反映。最常用的方法是分析SEREX抗原在肿瘤和正常人血清中的反应情况， 那些在肿瘤和正常人之间血清抗体反应明显不同的抗原被认为是肿瘤相关抗原。因此发展一种简便快捷的筛选方法对于加快肿瘤抗原的发现具有重要意义。我们在实践中发现采用传统的噬菌斑筛选法费时费力， 对于大量的候选阳性克隆的筛选更是如此， 成为限制SEREX广泛应用的一个重要因素。

　　本研究中， 我们采用一种新的基于免疫印迹的抗原克隆微阵列检测方法可以较好地解决这个问题。本研究结果显示， 采用该方法得到的血清反应阳性率与传统方法完全一致， 并且两种检测方法得到的结果， 均在随后对纯化的抗原的ELISA检测中得到了验证， 结果一致性也非常高。另一方面， 采用抗原克隆微阵列检测方法可以同时检测多个抗原克隆， 具有高通量的特点。在我们进行的食管癌抗原克隆的初筛中， 最多一次可检测多达50个克隆， 这大大提高了检测的效率。另外， 多个抗原同时被检测， 可以比较各抗原之间与血清中抗体的反应强度的差别， 这在传统的噬菌斑筛选法中是无法进行的。这些结果均表明， 采用抗原克隆微阵列检测方法可以完全代替传统的噬菌斑筛选法， 可用于血清学筛选肿瘤cDNA文库中分析SEREX抗原在肿瘤和正常人血清中的反应情况， 从而获得有意义的肿瘤相关抗原。

参考文献

［1］ Sahin U， Türeci O， Schmitt H， et al. Human neoplasms elicit multiple specific immune responses in the autologous host［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1995， 92: 11810-11813.

［2］ Lee SY， Obata Y， Yoshida M， et al. Immunomic analysis of human sarcoma［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2003， 100(5): 2651-2656.

［3］ Scanlan MJ， Welt S， Gordon CM， et al. Cancerrelated serological recognition of human colon cancer: identification of potential diagnostic and immunotherapeutic targets［J］. Cancer Res， 2002， 62(14): 4041-4047.

［4］ Yu L， Hu H， Ran YL， et al. Human esophageal carcinoma antigens screened by serologic analysis of recombinant cDNA expression libraries (SEREX)［J］. Ai Zheng， 2007， 26(1): 100-105.

［5］ Zhang JY， Casiano CA， Peng XX， et al. Enhancement of antibody detection in cancer using panel of recombinant tumorassociated antigens［J］. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev， 2003， 12(2): 136-143.

［6］ 闫静辉， 吴 萌， 程 华， 等. 抗体微阵列构建过程中抗体定位固定技术研究［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23（7）: 684-686.