Ph（）慢性骨髓增殖性疾病JAK2V617F检测技术及临床应用的进展

【摘要】 2005年以来多个研究组报道了在Ph（）慢性骨髓增殖性疾病患者的外周血和骨髓中存在JAK2V617F突变， 所用的检测方法有DNA直接测序、 序列特异性PCR、 实时定量PCR与DNA溶链曲线分析、 限制性片段长度多态性、 焦磷酸测序， 兹就这些方法的原理、 敏感性以及临床应用进行综述。

【关键词】 慢性骨髓增殖性疾病; 突变; 检测方法

　　慢性骨髓增殖性疾病（chronic myeloproliferative disorders， CMPDs）是一组发生在造血干细胞水平的克隆性疾病， 主要特征是骨髓一个或多个系列相对成熟的细胞的过度增殖， 外周血细胞数量增多， 常伴有肝脾肿大。其中真性红细胞增多症（polycythemia vera， PV）、 原发性血小板增多症（essential thrombocythemia， ET）、 慢性特发性骨髓纤维化（chronic idiopathic myelofibrosis， CIMF）以及慢性髓性白血病（chronic myelogenous leukemia， CML）为经典的CMPD。除CML外， 其余几种称为经典的Ph（）的骨髓增殖性疾病［1］。2005年国外4个不同的研究小组几乎同时报道了有关JAK2基因突变在PV、 ET和CIMF发病中的作用［2， 3］， 从而揭开了Ph阴性的CMPD发病机理研究的序幕。

　　Jak2是JAK家族4个成员（TYK2、 JAK1、 JAK2、 JAK3）中的一员， 为非受体型酪氨酸激酶， 位于9号染色体短臂（9p24）， 在造血调节中起着重要的作用［4］。JAK2V617F是发生在造血干/祖细胞水平的体细胞功能获得性突变， 功能研究以及模式动物研究显示该突变可引起JAK2激酶及下游信号通路的持续活化， 导致细胞恶性增殖和凋亡抑制， 最终引起PV等疾病的发生［5］。但因各家采用的疾病诊断标准以及JAK2突变的检测手段不同， 患者JAK2 V617F发生率报告也不尽相同［6］。

　　1 DNA直接测序法

　　DNA直接测序（direct DNA sequencing）的基本特点: 把待测序的DNA分子进行处理， 得到每个只差1个核苷酸的一系列逐步缩短的DNA分子混合物; 通过凝胶电泳把这些DNA分子分离开来， 形成阶梯状排列的条带， 然后逐个读出DNA的碱基序列。Sanger的双脱氧核苷酸末端终止法是目前用的比较多的测序法， 原理是利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ， 以单链DNA为模板合成互补的DNA链， Sanger引入双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为链终止剂， 与脱氧核糖核苷(dNTP)不同的是， 前者的脱氧核糖的3'位置缺少一个OH， 因此不能同后续的dNTP形成磷酸二脂键， 正在增长的DNA链不可能继续延伸， 这样反应产物是一系列的核苷酸链。在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddNTP， 结果将产生4组寡核苷酸。利用荧光标记ddNTP， 将产物毛细凝胶电泳后利用标准复合波长的荧光监测器就可完成测序［7］ 。

　　DNA测序的优点为结果比较直接可见， 可以提供所测序列的详细资料， 但是在产生的色普图中的背景干扰比较多， 所以敏感性比较低［6］。此方法在进行研究时作用比较大， 但是在临床检测中面临着挑战。对于髓系疾病， 所取骨髓标本中常常是肿瘤组织与正常造血组织并存， 这样提取的基因中含突变的DNA的含量会较少， 尤其是纯合子比例很低的ET以及MDS， MDS的突变表型可能只在低于10％的骨髓细胞的微小克隆中表达， 这样阳性检出率会很低， 并且费时耗资， 达不到临床要求。

　　随着Ph阴性MPD发病机制的进一步研究， JAK2其他位点突变的报道越来越多［8-10］， 在其他恶性血液病中JAK2突变也时有报道［11］， 因此在探讨未知突变时， 尽管直接测序法存在着敏感性差的缺点， 其直观性强的优点显露无遗。

　　2 序列特异性PCR

　　序列特异性PCR(allelespecific PCR)的原理是设计两对引物， 一对为常规针对目的序列的引物， 另一对引物作为探针， 予荧光标记， 一条针对含有突变的模板， 一条针对正常的不含突变的模板。Jones等［12］设计了一对引物和一对探针。两探针引物3′的第1个碱基会在突变位点退火， 而3′端的第3个碱基故意不配对以增大特异性。再利用琼脂糖凝胶电泳区分出野生型以及突变型产物。

　　Jones等［12］利用这两对引物检测MPD中JAK2突变， PV中阳性检出率为81％; Baxter等［2］利用此法但是利用不同的引物检测PV中JAK2V617F的检出率为97％; 而用常规荧光染料化学测序法， 此组患者JAK2V617F的检出率仅为73%， 故ARMS法检出率大大提高。这两个研究小组的研究分别显示， 只要存在1%～2%或者3%的突变细胞， ARMS法就能检出。而McClure研究小组报道的敏感性甚至高达0.01%［13］。尽管目前临床上检出微小突变克隆的作用并不是太大， 但是长远看来， 如果开发出JAK2分子靶向抑制剂， 需要临床观察随访的时候， ARMS法敏感性高的优点就比较突出了。

　　序列特异性PCR或者ARMS是一种用于已知突变检测的方法， 其优点就是敏感性高， 事实上， 文献报道MPD中JAK2突变几率最高的研究组采用的就是这种检测手段［2］。但是ARMS法也有其局限性: 首先， 扩增过程中必须设立一个对照反应体系， 否则， 如无产物， 就不能区分到底是反应体系的失败还是所测标本没有突变; 其次， 其结果受限于PCR反应的扩大效能; 再次， ARMS虽然敏感性最高， 但是它不是一种定量检测方法， 不能作为微小残留病灶的检测， 在MPD随访和分子缓解判断中的作用有限［14］。

　　3 实时定量PCR与DNA溶链曲线分析

　　实时PCR反应体系中有一对未标记的引物， 以及一对荧光杂交探针， 其中一个为供者荧光基团， 另一个为受者荧光基团， 探针中一个用以检测突变位点， 并且包含着与野生型序列互补的序列， 这个探针与野生型模板的结合比与突变模板的结合更为紧密。以往的检测手段只能检测出有没有突变， 或者只是半定量的检测， 有研究小组用实时定量PCR对JAK2V617F进行了分析， 并且比较了3种检测手段的敏感性［14］ 。这种检测方法的检测敏感度较ARMS略低， 为2.5％。

　　互补的DNA双链的稳定性强于有碱基错配的DNA双链稳定性， 这就决定了两者的解链温度不一样， 可以根据温度梯度来区别出有碱基错配的DNA， 这就是DNA溶链曲线分析的原理。实时PCR与DNA溶链曲线分析连用可以用于JAK2V617F的检测［13］， 当达到解链温度时， 探针与PCR模板解离， 荧光消失， 通过能量转移， 可以通过仪器收集此改变， 而达到检测的目的。James等［15］用倍比稀释法， 混合了JAK2V617F阳性和阴性细胞株， 系列样本上比较了两种实时定量PCR突变（分别用LightCycler和Taqman ABI7500机器）和荧光染料化学测序法这三者的敏感性， 结果实时定量PCR方法的敏感性在0.5%～1%， 高于直接测序法。尽管目前多个研究小组， 选择不同引物序列， 得到的DNA溶链曲线不尽相同［13］， 但是都推崇实时定量PCRDNA溶链曲线分析的方法用于临床初筛实验， 认为如果是阳性， 临床上预示MPD诊断的阳性率是100%［15］。

　　4 限制性片段长度多态性

　　限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism， RFLP)原理为内切酶根据特定的酶切位点将DNA切为两段， 特异性针对JAK2V617F的酶为BsaXI， 这个酶针对的位点为BsaXI内切酶识别序列为5(N)9AC(N)5CTCC(N)l03， JAK2V617突变因GT， 相应序列变为5(N) AA(N) CTCC(N)103 ， 破坏了限制性内切酶BsaXI的酶切识别位点， 不能酶切， 野生型JAK2完全酶切， 经电泳后可以鉴别; 此方法所需实验设备简便， 但是结果准确性不高， 其结果受限于酶的效能以及酶与底物的比例。所以其敏感度只有20％左右， 并且其阳性结果需要经过其他的检测手段来确认， 如DNA测序等。但是和其他方法相比， RFLP费用较低， 耗时较少［6］。Baxter等［2］就成功的利用此方法检测过造血细胞克隆中的JAK2突变， 国内研究小组也利用这种方法检测出50％的PV患者中存在突变［16］。 事实上国外开发出了RFLP方法检测JAK2V617F的试剂盒， 但仅仅供研究用， 说明该法由于敏感性低， 可能导致假阴性结果， 不具备临床检测价值。5 焦磷酸测序

　　焦磷酸测序(pyrosequencing)技术是由Nyren等人于1987年发展起来的一种新型的酶联级联测序技术， 焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析， 其可重复性和精确性能与SangerDNA 测序法相媲美， 而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。焦磷酸测序技术的原理是: 引物与模板DNA 退火后， 在DNA 聚合酶、 ATP 硫酸化酶、 荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4 种酶的协同作用下， 将引物上每一个dNTP 的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来， 通过检测荧光的释放和强度， 达到实时测定DNA序列的目的［17］。优点是省去了额外的PCR过程， 而且是半定量的， 敏感度为5％～10％， 但是因为这种检测方法是每次DNA延长的时候才加入dNTP， 这就决定了检测的目的基因不能太长， 引物设计时应该注意这一点， 并且这种办法比较昂贵， 实用性可能不大［6］。

　　Jones等［12］利用ARMS以及直接测序的方法检测MPD患者的JAK2突变的存在， 但是这两种方法并不能检出纯合子与杂合子， 但用焦磷酸测序技术成功的检测出V617F与野生型序列的比例。另外， 突变还有其他的检测方法， 比如单链构成多态性、 变性梯度凝胶电泳、 高效液相层析以及单核苷酸延伸法等， 但是这些检测手段对仪器以及费用的要求较高， 不太适合临床检测， 而且阳性检出结果一般都还需要别的检测手段来确认。

　　随着对JAK2V617F研究的深入， 在其他疾病中也发现了JAK2V617F突变。在不典型CML和无法分类的骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome， MDS）患者， JAK2V617F的检出率可达20％［11］; 在HES和CMML患者检出率低至2%～3%; AML患者罕见该种突变。JAK2V617F突变发现后， WHO也逐渐在建立新的分子水平的分类法［18， 19］， JAK2基因和/或其他基因在此类疾病的诊断以及临床应用中的作用逐渐彰显， 这需要我们在今后的研究中发现更简便和更灵敏的突变检测手段。

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