IL12和IL10与实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠发病的相关性

　　　　 作者：檀国军， 徐 玉， 王秀丽， 朱一飞， 刘静， 郭力

【摘要】 目的: 探讨IL12及IL10与实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠发病的相关性。方法: 以豚鼠全脊髓匀浆与福氏完全佐剂为抗原免疫Wistar大鼠建立EAE模型。取脑、 脊髓组织石腊包埋， 病理切片， 光镜观察; 采用双抗体夹心法ELISA检测Wistar大鼠免疫后7、 14、 21 d不同时间段血清中IL12、 IL10的含量。结果: EAE组免疫后第7天IL12水平即出现明显上调， 早于临床症状的发生， 随免疫后时间的延长， IL12表达呈逐渐增高后缓慢下降的变化趋势， 并且与EAE大鼠病情评分呈明显正相关(r=0.951， P&<0.01)。免疫后第21天EAE组IL10水平与CFA组和NS组比较明显升高(P&<0.01)。结论: IL12和IL10分别与EAE的发病和缓解密切相关。

【关键词】 脑脊髓炎; 自身免疫性; 实验性; IL12; IL10

　　多发性硬化(multiple sclerosis， MS)是临床常见的中枢神经系统(central nervous system， CNS)炎性脱髓鞘的自身免疫性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis， EAE)是CD4+T细胞介导的CNS自身免疫性脱髓鞘疾病， 是MS的经典动物模型。目前MS的发病机制尚不清楚， Karpus等［1］认为与Th1/Th3失衡有关。研究表明， Th1与Th3类细胞因子(cytokine， CK)的表达分别与EAE病情进展和缓解相关［2］。本研究通过观察EAE大鼠血清中IL12、 IL10水平变化， 目的在于探讨IL12及IL10与EAE发病的相关性， 以期为深入了解MS的发病机制、 探索新的有效治疗途径和病情的监测提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 雌性Wistar大鼠(72只， 6～8周龄， 体质量180～200 g)、 清洁级雌性豚鼠(5只， 体质量350～400 g)均购自河北医科大学实验动物中心。卡介苗(60 g/L)为北京生物制品所提供; 完全福氏佐剂购自美国Sigma公司; IL12、 IL10双抗体夹心ELISA试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组法 将健康、 雌性Wistar大鼠72只， 随机分3组: (1)EAE组， 36只， 诱导后随机分7、 14、 21 d 3个亚组， 每亚组各12只大鼠; (2)完全福氏佐剂(complete Freund’s adjuvant， CFA)组: 18只， 以CFA免疫大鼠， 分组同EAE组， 每亚组各6只大鼠; (3)生理盐水(normal saline， NS)对照组: 18只， 仅注射NS， 分组同CFA组。

　　1.2.2 完全抗原的制备 健康350～400 g雌性豚鼠5只用100 g/L水合氯醛350 mg/kg腹腔注射至四肢瘫软， 迅速取其全脊髓。按1 g脊髓∶1 mL NS在冰槽中用超声细胞粉碎仪制成500 mL/L的豚鼠全脊髓匀浆(guinea pig spinal cord homogenate， GPSCH)， 与等量含4 g/L卡介苗的CFA充分混合至油包水乳剂， 制成完全抗原。

　　1.2.3 建立EAE大鼠模型及临床评分 EAE组经大鼠四肢足垫皮下注射抗原匀浆0.4 mL/只， 佐剂组为CFA代替抗原匀浆同法注射， 正常对照组皮下均注射NS。记免疫当日为第0天， 进行临床症状评分， 参照Kono等［3］提出的标准， 分为5级: Ⅰ级动物尾部无力; Ⅱ级尾部无力+肢体无力; Ⅲ级肢体轻度麻痹; Ⅳ级肢体严重麻痹， 被动翻身后不能复原; Ⅴ级濒死状态。

　　1.2.4 组织病理学检查 所有动物于免疫后在不同的时间点处死， 留取血清， 麻醉后先以NS左心室冲洗， 再用40 g/L多聚甲醛灌注固定， 切取大脑视交叉层面2 mm脑组织、 小脑、 脑干、 颈膨大、 胸段及腰膨大脊髓固定于40 g/L多聚甲醛中， 石蜡包埋切片， 行HE染色。

　　1.2.5 ELISA检测 血清IL12、 IL10水平的表达， 用双抗体夹心ELISA检测。

　　1.2.6 统计学分析 采用SPSS11.0统计软件进行统计分析， 数值用x±s表示， 单因素多组比较用方差分析， 两组之间比较用t检验， 症状评分间比较用相关分析。

2 结果

　　2.1 EAE大鼠的发病情况 EAE组大鼠免疫后出现精神萎靡、 食欲减退、 皮毛不光滑， 自第10天开始发病， 症状表现为不同程度的尾部张力消失、 无力; 第14天进入发病高峰， EAE组动物全部发病， 发病率为100%， 此期症状最严重， 双后肢甚至四肢无力、 麻痹， 大小便失禁， 一只动物因病情严重而死亡， 平均症状评分3.88±0.68; 至第21天动物症状缓解， 体质量也逐渐恢复(图1)。CFA组和NS组大鼠没有发病， 状态及体质量无明显变化。

　　2.2 病理组织学检查 EAE组发病大鼠脑脊髓组织HE染色可见， 在其发病早期CNS内有单核淋巴样细胞散在浸润; 发病高峰期CNS内大量的单核淋巴样细胞浸润， 尤其在小血管周围形成典型“袖套样(cuffing)”改变(图2)， 提示血脑屏障( bloodbrain barrier， BBB)被严重破坏; 缓解期CNS内单核淋巴样细胞浸润程度明显减轻。病变累及部位涉及大脑、 小脑、 脑干、 脊髓等， 以白质为主。CFA组和NS组大鼠脑和脊髓均未见异常。

　　图1 EAE大鼠免疫后临床症状评分

　　图2 血管套袖样改变 (HE， ×400)

　　2.3 血清IL12水平的变化 EAE组血清中IL12在潜伏期(注射后7 d)上调， 随着EAE大鼠进入症状高峰期(注射后14 d)， IL12水平亦达高峰， 恢复期(注射后21 d)IL12水平下降， EAE组在注射后7、 14和21 d血清中IL12水平分别为(11.407±0.208)ng/L、 (28.108±0.028)ng/L和(14.456±0.259)ng/L。EAE组3个时间点IL12水平与对照组相比均有统计学意义(P&<0.01); 其症状高峰期(注射后14 d)IL12水平与潜伏期(注射后7 d) 及恢复期(注射后21 d)相比有统计学意义(P&<0.01， 图3)。CFA组与NS组在相应时间血清中IL12水平比较无统计学意义(P&>0.05)。

　　图3 EAE组与CFA组、 NS组注射后7～21 d血清中IL12水平比较

　　bP&<0.01 vs CFA or NS group; dP&<0.01 vs day 7 or day 21.

　　2.4 血清IL10水平的变化 在注射后7～21 d， EAE组血清IL10的水平呈逐渐升高的趋势， 潜伏期(注射后7 d)和症状高峰期(注射后14 d)IL10有所表达， 但与对照组血清中IL10水平比较无统计学意义; 恢复期(注射后21 d)水平与对照组比较明显升高(P&<0.01)。注射后7～21 d CFA组与NS组血清中IL10水平比较无统计学意义(图4)。

　　2.5 相关性分析 EAE组注射后14 d症状评分与IL12水平进行相关分析(r=0.951， P&<0.01)， 显示EAE症状评分与IL12的水平呈明显正相关(图5)。

　　图5 EAE组注射后14 d 血清中IL12水平与症状评分的相关性

3 讨论

　　MS的病因和发病机制迄今尚未完全明了， 许多研究表明多发性硬化患者中存在Thl/Th3类CK的失衡， Thl细胞主要分泌促炎症性CK (如IL2、 IL12、 IFNγ、 TNFα和淋巴毒素等)， 这些CK通过激活巨噬细胞， 介导迟发性变态反应引发EAE; Th3细胞主要分泌抑炎症性CK (如IL4、 IL5、 IL10、 IL6等)， 促进B细胞增殖成熟， 产生抗体， 故可增强抗体介导的免疫应答， 抑制或逆转EAE的发生。在EAE病情演化中， 由CK构成的免疫调节网络对其发生、 发展及缓解起着重要而复杂的调节作用［4］。

　　在EAE早期的CNS巨噬细胞和小胶质细胞上有IL12受体的表达， 使CNS的淋巴细胞发生Thl偏移［5］。进一步研究发现， IL12Rβ1基因敲除EAE鼠发生Th3偏移， 因而抑制EAE的发展， 而IL12Rβ2基因敲除鼠仍然发生EAE［6］。IL12p35基因敲除鼠也同样发生EAE， 而IL12p40基因敲除鼠不发生EAE。有研究认为， 由APC分泌的IL12是导致Th0细胞向Th1细胞分化产生IFNγ等促炎细胞因子从而启动针对CNS髓鞘成分的自身免疫攻击、 诱发EAE的关键因素［7］。IL10作为抑制性CK于1989年被首次报道， 此后IL10作为抑制炎症反应的免疫抑制因子被广泛关注。IL10主要由Th3细胞、 单核巨噬细胞和B细胞产生。众多的证据已表明IL10作为抑炎症性CK之一， 在调节免疫反应中起着非常重要的作用。Samoilova等［8］研究表明， IL10基因敲除的小鼠对实验性变态反应性脑脊髓炎有更强的易感性并且病情更严重， IL10转基因小鼠能抵抗实验性变态反应性脑脊髓炎的发生， 证实了IL10对EAE动物的保护作用。有文献报道， 与IL4相比， IL10基因缺陷鼠引发严重的EAE， 说明IL10抑制EAE的地位尚不能被其它CK所取代， 其对EAE耐受的作用潜力巨大。

　　通过本实验结果发现， EAE大鼠在潜伏期IL12表达即出现明显上调， 早于临床症状的发生， 随免疫后时间的延长， IL12表达呈逐渐增高， 随着EAE大鼠进入症状高峰期， IL12表达水平亦达高峰， 恢复期IL12表达水平下降， 并且IL12表达与EAE大鼠发病呈明显正相关。 但在EAE潜伏期和活动期IL10水平与对照组差异不大; 对比潜伏期、 活动期和缓解期IL10水平， 后者更高， 提示IL10在EAE缓解期起重要作用， 研究揭示在EAE小鼠CNS IL10的表达与EAE病情恢复有关。综合上述实验结果， 表明IL12和IL10的表达分别与EAE的发病和缓解密切相关， 在EAE的发病早期IL12和IL10均表达上调， 其中IL12的表达与对照组比较有明显差异; 随着EAE发病进入高峰期， IL12的表达亦达高峰， IL10的表达变化不明显; 当EAE病情缓解时， IL12的表达下降， 而IL10的表达与对照组比较明显上调。进一步证实EAE大鼠发病期Th1/Th3类CK同时上调， 表现为以Th1类CK占主导地位的免疫偏离。目前纠正Th1/Th3失衡已成为新的治疗策略之一， 随着对CK认识的深入， 将有助于发展免疫治疗方法， 进而为临床诊治MS提供实验依据。

参考文献

［1］ Karpus WJ， Ransohoff RM. Chemokine regulation of experimental autoimmune encephalomyelitis: temporal and spatial expression patterns govern disease pathogenesis［J］. J Immunol， 1998， 161(6): 2667-2671.

［2］ Olsson T. Critical influences of the cytokine orchestration on the outcome of myelin antigenspecific Tcell autoimmunity in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis［J］. Immunol Rev， 1995， 144: 245-268.

［3］ Kono DH， Urban JL， Horvath SJ， et al. Two minor determinants of myelin basic protein induce experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice［J］. J Exp Med， 1988， 168(1): 213-227.

［4］ Imitola J， Chitnis T， Khoury SJ. Cytokines in multiple sclerosis: from bench to bedside［J］. Phannacol Ther， 2005， 106(2): 163-177.

［5］ Becher B， Durell BG， Noelle RJ. Experimental autoimmune encephalitis and inflammation in the absence of interleukin12［J］. J Clin Invest， 2002， 110(4): 493-497.

［6］ Bagaeva LV， Williams LP， Segal BM. IL12 dependent/IFN gamma independent expression of CCR5 by myelinreactive T cells correlates with encephalitogenicity［J］. J Neuro Immunol， 2003， 137(1-2): 109-116.

［7］ Trinchieri G， Pflanz S， Kastelein RA. The IL12 family of heterodimeric cytokines: new players in the regulation of T cell responses［J］. Immunity， 2003， 19(5): 641- 644.

［8］ Samoilova EB， Horton JL， Chen Y. Acceleration of experimental autoimmune encephalomyelitis in interleukin10deficient mice: roles of interleukin10 in disease progression and recovery［J］. Cell Immunol， 1998， 188(2): 118-124.