自体肿瘤特异性CTLs对裸鼠人乳腺癌移植瘤的抑瘤作用

　　　　 作者：杨超， 单保恩 刘运江， 王士杰

【摘要】 目的: 研究乳腺癌患者腋下淋巴结细胞诱导产生的肿瘤特异性CTLs在裸鼠体内对患者自身乳腺癌生长的抑制作用。方法: 在裸鼠胸垫处种植人乳腺癌组织， 建立裸鼠乳腺癌移植瘤模型。以细胞因子联合诱导乳腺癌患者腋窝淋巴结单个核细胞成为DC和肿瘤特异性CTL（sCTL）、 非特异性CTL（nCTL）和异体CTL（vCTL）; 将不同CTLs注射到荷瘤裸鼠的肿瘤周围， 观察其对肿瘤生长的抑制作用。结果: 人乳腺癌移植瘤在裸鼠体内的成活率为100％。组织病理学证实移植瘤为乳腺浸润性导管癌。与对照组相比， 荷瘤裸鼠移植瘤的体积在sCTL、 nCTL和vCTL治疗组均明显减小(P&<0.05)， sCTL对自体移植瘤的生长抑制作用最强［平均瘤体积(82.70±2.09) mm3］， 抑瘤率50.5％， 明显高于nCTL组［(96.15±5.35) mm3， 26.9％］和vCTL组［(96.93±4.51) mm3， 25.7％］， (P＜0.01); 不同CTL治疗组瘤组织内可见大量淋巴细胞和树突状细胞(DC)浸润。结论: 乳腺癌裸鼠移植瘤模型成功率高， 病理学证实与人乳腺癌特征相符， 且有DC和大量特异性CTL浸润。自体特异性CTL对裸鼠体内自体乳腺癌移植瘤有较强的抑制作用。

【关键词】 乳腺癌; 肿瘤引流区淋巴结细胞; 裸鼠模型; 免疫治疗

　　乳腺癌是当今危害妇女健康的主要恶性肿瘤。虽经手术、 化疗、 放疗及内分泌治疗等综合治疗， 但40%患者仍死于肿瘤复发和转移［1］。近年来， 随着肿瘤免疫学的发展， 以树突状细胞（dendritic cell， DC）为基础构建的乳腺癌疫苗成为当今研究的热点。本研究中我们以细胞因子联合诱导培养腋下淋巴结细胞为DC和肿瘤特异性CTL， 观察其对裸鼠乳腺癌移植瘤生长的抑制和杀伤作用。

1 材料和方法

　　1.1 材料 选取2005-11/2006-02在我科住院手术的乳腺癌患者10例， 年龄41～67岁， 中位年龄52.9岁， 均为女性， 术前均未行放、 化疗， 术后病理为乳腺浸润性导管癌。手术时无菌摘取腋窝引流区肉眼判断无肿瘤转移的淋巴结2～3枚， 选取其中2例患者的肿瘤组织切成约1.5 cm3， 用于建立裸鼠移植瘤模型。 实验动物: SPF级BALB/c裸鼠（32只， 3～4周龄， 体质量13～15 g， 雌性）购于中国医学科学院动物中心。RMPI1640培养基购自 Promega公司; 胎牛血清购自杭州四季青生物试剂公司; rhGMCSF、 rhIL2、 rhIL4 购自Cytolab公司; 抗CD1a、 CD83、 CD86单克隆抗体（mAb）购自Biolegend公司; 抗CD3 mAb、 抗CD4、 CD8 mAb购自Coulter公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 DC的诱导培养、 自体肿瘤特异性CTL、 nCTL和vCTL的制备 术中取其中1名乳腺癌患者（A）区域引流淋巴结制成单细胞悬液， 分离贴壁细胞， 用rhGMCSF和rhIL4诱导培养为DC， 并与乳腺癌细胞冻融悬液共培养， 使之负载肿瘤抗原; DC与悬浮淋巴细胞共培养为特异性CTL(specific CTL， sCTL); 未负载肿瘤抗原的DC刺激淋巴细胞产生非特异性CTL（non specific CTL， nCTL)， vCTL制备方法同异体CTL(varient CTL， sCTL)， 但是用其杀伤另一名患者（B）肿瘤。详细方法参照文献［2］。

　　1.2.2 人乳腺癌裸鼠移植瘤模型的建立及处理 将2名患者乳腺癌组织块种植于裸鼠胸垫皮下， 2周后， 移植瘤生长良好， 将裸鼠随机分为4组， 每组8只。（1）肿瘤特异性CTL治疗组: 每只裸鼠每次于肿瘤局部注射自体肿瘤特异性CTLs（5×109/L）0.2 mL; （2）非特异性CTL治疗组: 每只裸鼠每次局部注射非特异性CTLs（5×109/L） 0.2 mL; （3）异体CTL治疗组: 种植另一患者（B）乳腺癌组织， 每只裸鼠每次于肿瘤局部注射患者（A）自体肿瘤特异性CTLs（5×109/L） 0.2 mL; (4)空白对照组: 每只裸鼠于肿瘤局部注射生理盐水0.2 mL。以上各组每5 d肿瘤周围注射1次， 共3次。每5 d用游标卡尺测量记录肿瘤长径（a）、 短径（b）， 按体积(V)=πab2/6计算肿瘤体积。30 d脱颈处死裸鼠取出移植瘤标本。肿瘤生长抑制率＝｛［1－(实验组结束时瘤体积－实验组开始时瘤体积) ］/(空白对照组结束时瘤体积－空白对照组开始时瘤体积｝×100％。

　　1.2.3 移植瘤的组织学观察 将移植瘤取出后制成石蜡切片， 常规HE染色， 显微镜观察肿瘤细胞的形态学和凋亡情况; 免疫组化SP法观察DCs（标志物为CD83）和特异性CTL（标志物为CD3、 CD4、 CD8）浸润情况。

　　1.2.4 统计学分析 应用SPSS11.5统计软件进行统计。各组移植瘤体积和抑瘤率用x±s表示; 3种治疗方法是否有明显差异采用General Linear Model中Repeated Measures进行统计; 如有明显差异各组间采用Oneway ANOVA进行统计， 进一步两两比较采用LSD进行统计。P&<0.05有明显统计学意义。2 结果

　　2.1 不同CTLs治疗对移植瘤体积的影响 将乳腺癌组织移植到裸鼠体内成活并逐渐生长， 2周后移植瘤体积约为50 mm3。治疗前， sCTL、 nCTL和vCTL组荷瘤小鼠的肿瘤体积与空白对照组移植瘤体积无统计学意义（P &>0.05， 表1）。经sCTL、 nCTL和vCTL治疗后， 肿瘤体积与对照组相比明显缩小， 以sCTL组抑瘤效果最明显（P&<0.01， 表1）; 各治疗组体积之间进一步两两比较结果显示， 每次治疗后sCTL组与nCTL组和vCTL组移植瘤体积均有统计学意义（P&<0.01）， 而nCTL组与vCTL组移植瘤体积无统计学意义。移植瘤体积生长曲线见图1。表1 经不同CTLs治疗后人乳腺癌裸鼠移植瘤体积变化

　　2.2 不同CTLs治疗对荷瘤小鼠抑瘤率比较 经sCTL、 nCTL和vCTL治疗的荷瘤小鼠， 移植瘤生长都受抑制， 随着治疗次数增加和时间延长， 抑瘤率逐渐增加（P&<0.05， 表2）， 但各个治疗阶段sCTL组抑瘤率明显高于nCTL组和vCTL组（P&<0.05）。表2 不同CTLs治疗组对荷瘤小鼠抑瘤率的比较

　　2.3 移植瘤标本病理学观察 实验结束时， 摘取各组荷瘤小鼠肿瘤组织。肉眼观察肿瘤标本呈圆形或卵圆形， 实性， 表面不光滑， 与周围组织界限较清， 易剥离。所有裸鼠未见体内其余脏器转移灶。肿瘤组织切片经HE染色， 显微镜下可见空白对照组癌细胞大小不一， 排列成巢状或条索状， 间质少， 有散在坏死灶; 胞质丰富， 核大， 核异型性明显， 癌细胞向周围组织浸润， 病理诊断为浸润型导管癌（图2A）。经sCTL、 nCTL和vCTL治疗后， 移植瘤标本均可见瘤组织周围有大量淋巴细胞浸润， 并可见癌组织坏死（图2B）。免疫组化结果显示， 3种CTLs治疗组移植瘤癌组织中均可见CD83+阳性（DC细胞）、 CD3+、 CD8+、 CD4+细胞浸润（图3）， 对照组未见阳性细胞。

3 讨论

　　肿瘤引流区域淋巴结细胞（TDLNC）在机体肿瘤免疫中具有重要的作用［3］。TDLNC中的特异性CTL虽可被肿瘤抗原刺激而致敏， 但由于缺乏协同激活信号而处于失能状态， 不能有效地发挥其杀伤肿瘤细胞的作用［4， 5］。因此， 如何有效提高TDLNC中T细胞的杀伤活性， 对于控制肿瘤转移、 延长肿瘤患者生存期具有重要意义。非成熟DC是人体内功能最强的抗原提呈细胞， 其摄取、 提呈抗原后， 激活初始CD8+T细胞， 介导抗原特异性细胞毒性T细胞效应［6］。乳腺癌患者体内的DC数量与正常个体相比明显减少， 且功能低下。因此， 目前多采用体外模拟DC的成熟过程， 使其接触肿瘤抗原而致敏， 再将其回输体内， 可相对特异地诱导机体肿瘤特异性免疫应答， 起到治疗作用［7］。

　　本研究中我们采用人乳腺癌裸鼠移植瘤模型用不同CTL进行治疗， 所选用的裸鼠为去除胸腺的先天性T细胞免疫缺陷动物， 免疫排斥反应缺失; 人乳腺的肿瘤组织中含有肿瘤生长基质， 将瘤组织种植于裸鼠胸垫部， 此处是乳腺生长部位， 且血运丰富。肿瘤被移植于裸鼠后生长状态良好， 并能保持肿瘤细胞的原有形态和生物学特性［8-10］。种植2周后肿瘤生长良好， 开始进行免疫治疗。结果显示， 在20 d各组肿瘤体积差异不大， 考虑CTL输入裸鼠体内时， 肿瘤细胞正在大量增殖， 淋巴细胞杀伤肿瘤细胞， 抑制肿瘤细胞的生长， 需要大约1周才能出现明显的治疗效果， 随着时间延长各组差异越明显， 在30 d sCTL、 nCTL和vCTL治疗组的肿瘤生长体积均明显小于对照组， 以sCTL组抑瘤效果最明显; 3种CTL治疗组抑瘤率不同， sCTL治疗组与nCTL组和vCTL组抑瘤率都有统计学意义。说明以自身抗原致敏的DCs与TDLNC共培养， 诱导得到的sCTL对自身实体瘤有明显的杀伤作用; 而nCTL对乳腺癌移植瘤亦有一定抑瘤效果， 可能为DC经TNFα诱导成熟后， 使CTL具有一定非特异性杀伤活性， 或TDLNC中含有少量DC并经肿瘤细胞致敏， 从而诱导T细胞增殖， 但数量较少， 并且处于“失能”状态; 自体特异性CTL对异体肿瘤也具有一定抑瘤效果， 可能因为不同乳腺癌细胞存在某些相同肿瘤相关抗原， 从而诱导CTL产生杀伤作用。

　　本研究结果表明， 肿瘤抗原特异性CTLs对裸鼠人乳腺癌自体移植瘤有明显的抑瘤作用。

参考文献

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