【摘要】 目的: 探索HeLa细胞血清饥饿法周期同步化的培养条件。方法: 采用流式细胞术(FCM)研究了血清浓度及饥饿时间对HeLa细胞G0/G1期同步化及细胞凋亡的影响。结果: （1）当血清浓度处于0～10 mL/L， 饥饿时间为20～26 h时便可获得80%～90%的G0/G1期细胞;（2）当血清浓度处于0～2 mL/L且饥饿时间达到44 h以上时， 可以获得接近100%的G0/G1期细胞， 但此时饥饿时间越长， 凋亡细胞的比例会越高。结论: HeLa细胞可以通过血清饥饿法获得高纯度的G0/G1期细胞， 为周期相关研究提供了实验依据。
【关键词】 HeLa细胞; 血清饥饿法; 细胞周期同步化
在细胞周期的相关研究中通常要获得静止期细胞， 而根据研究者所需细胞群所处细胞周期的时相不同， 又有多种方法可供选择。其中， 血清饥饿法是能将细胞周期停滞于G0/G1期同时又较少影响细胞周期发育进程的一种简便有效的同步化方法［1， 2］。但采用血清饥饿法对不同细胞系进行同步化处理时， 所得的效果又千差万别， 而且大多数实验中无法任意选择已经摸索好条件的细胞系， 故实验室所用细胞的血清饥饿法条件摸索在实验中极为重要［3］。重点分析了人类宫颈癌细胞（HeLa细胞）的同步化效果， 并对血清浓度及饥饿时间进行了比较研究。
1 材料和方法
1.1 材料 人类宫颈癌细胞（HeLa细胞）引自中国科学院上海细胞所。RPMI1640培养基为美国Gibco公司产品。胎牛血清为HYclone公司产品。胰酶、 碘化丙啶（PI)及胰核糖核酸酶(RNaseA)为美国Sigma公司产品。FACSVantage SE型流式细胞仪为BD公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 培养基为含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液， 培养条件为37℃、 50 mL/L CO2及饱和湿度的恒温细胞培养箱中培养。
1.2.2 血清饥饿处理 将HeLa细胞培养至指数生长期后， 弃掉原培养液， 更换培养液的血清浓度分别为: 0、 1、 2、 5、 10、 100 mL/L， 继续培养， 然后分别在培养的20、 26、 32、 38、 44、 50、 56、 62、 68、 74 h收集细胞， 每个处理独立重复实验3次。
1.2.3 细胞周期检测 消化细胞， 离心后弃胰酶， PBS洗涤离心2次后弃上清。然后将采集的细胞均匀地分散在750 mL/L的预冷乙醇中， 置4℃冷藏备用。检测时， 用PBS离心洗涤细胞2次， 除去乙醇， 加少量PBS将细胞吹散(每份要求细胞数为5～10×105 )， 加入RNaseA(终浓度为0.5 g/L)， 37℃反应30 min， 加PI染液(终浓度为50 mg/L)（PI染液含Triton X100）， 避光染色15 min， 用FACSVantage SE型流式细胞仪检测。实验完毕后采用cellquest软件分析各期的细胞含量［4］。
2 结果
2.1 血清浓度及饥饿时间与细胞同步化程度的关系 流式细胞术（FCM）检测的结果显示: （1）当血清浓度为0、 1、 2、 5、 10 mL/L， 饥饿时间为20～26 h便可获得80%～90%的G0/G1期细胞， 此时可能饥饿仍不充分， 有一定量的细胞并未停在G0/G1期， 而发生“漏出”现象， 漏出的细胞缓慢进入S期甚至G2/M期［5］; （2）当血清浓度处于0、 1、 2 mL/L且饥饿时间达到44 h以上时， 可以获得接近100%的G0/G1期细胞; (3)当血清浓度处于0、 1、 2 mL/L时， 饥饿的20 h以上的任何时间段， 都可以收获约80%以上的G0/G1期细胞; （4）当血清浓度为5、 10、 100 mL/L， 饥饿时间达到32 h以上时， G0/G1期细胞含量均低于83.13%， 所以在HeLa细胞周期相关研究中， 如果想要获得高纯度的G0/G1期细胞， 血清浓度应选择为0、 1、 2 mL/L（图1）。
流式细胞仪的cellquest软件分析图显示: 当血清浓度为0 mL/L时， 细胞培养至20、 26、 32、 38 h时的G0/G1期、 S期、 G2/M分期明显， 图形整齐， 细胞碎片很少， 当细胞培养时间为44 h以上时， 所分析的图形有明显变化， 即G0/G1期细胞含量增多（同图1）， G2/M峰逐渐消失， S期细胞也变少， 并在G0/G1期的前边出现了亚二倍体的峰， 为细胞凋亡以及细胞碎片部分。而1 mL/L及2 mL/L血清浓度的细胞周期分析结果与上述的结果相类似。
2.2 血清浓度及饥饿时间与HeLa细胞凋亡的关系 根据之前的分析结果， 要想获得超过90%的G0/G1期细胞， 同步化实验中血清浓度应选择为0、 1、 2 mL/L。对于获得将近100%的G0/G1期细胞， 3种血清浓度的饥饿作用结果相差不大， 但是较低血清浓度的长时间培养势必带来大量的凋亡细胞， 需要研究的是究竟哪一种血清浓度， 多长的培养时间对细胞的影响较小？检测结果显示: 在饥饿时间低于38 h时， 3种血清浓度所带来的凋亡细胞均较少（低于4.5%）， 但从38 h之后， 细胞凋亡开始逐渐增加， 当饥饿时间超过50 h， 低浓度血清所造成的细胞凋亡比例要高于较高浓度的血清（图2）。综合以上的结果， 如果既考虑较高G0/G1期的细胞含量， 又要减少凋亡细胞的比例， 在进行HeLa细胞周期同步化时， 可以选择的血清浓度为0 mL/L、 1 mL/L和2 mL/L， 血清饥饿时间应考虑选择在44～50 h为宜， 最好选择在44 h， 即饥饿时间越短越好， 此时的凋亡细胞低于10%， 远远少于饥饿50 h所产生的凋亡细胞（20%左右）。
3 讨论
细胞分裂周期是一组和谐的、 高度调节性的系列事件。细胞周期的准确调控对生物的生存、 繁殖、 发育和遗传均是十分重要的。目前， 众多与细胞周期相关的实验要求获得大量处于“基态”的细胞， 即G0/G1期细胞， 这些细胞可用于观察细胞的外界因素对细胞周期的影响和分析其作用机制。血清饥饿法正是一种可快速地获得大量G0/G1期细胞的方法， 同时血清饥饿法因对细胞的干扰极小， 而广泛应用于各实验室。研究中分析了血清饥饿法中HeLa细胞同步化的影响因素: （1）当血清浓度处于0～10 mL/L， 饥饿时间为20～26 h便可获得80%～90%的G0/G1期细胞， 此时可能饥饿仍不充分， 有一定量的细胞并未停在G0/G1期， 而发生“漏出”现象， 漏出的细胞缓慢进入S 期甚至G2/M 期［5］; （2）当血清浓度处于0、 1、 2 mL/L且饥饿时间达到44 h以上时， 可以获得接近100%的G0/G1期细胞， 但此时饥饿时间越长， 凋亡细胞的比例会越高。
一般认为， 饥饿48 h足以筛选到合适的血清浓度， 饥饿时间不宜过长， 也不可太短［1］。因为大多数离体培养的哺乳动物细胞的周期长度在20～30 h［6］， 经过48 h 饥饿后， 细胞有足够的时间走完周期的全程。本研究中所使用的HeLa细胞其整个细胞周期时间约为20～28 h， 饥饿时间在44～50 h能够获得高纯度的G0/G1期细胞， 且凋亡率较低， 为周期相关研究提供了实验依据。
参考文献
［1］ Kues WA， Anger M， Carnwath JW， et al. Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors［J］. Biol Reprod， 2000， 62(2): 412-419.
［2］ Chou RC， Langan TJ. In vitro synchronization of mammalian astrocytic cultures by serum deprivation［J］. Brain Res Protoc， 2003， 11(3): 162-167.
［3］ 宋春娇， 吕冰洁， 张小玲， 等. 血清饥饿法用于细胞周期同步化的方法学研究［J］. 中国地方病学杂， 2003， 22(4): 362-364.
［4］ 栾希英， 张光波， 胡玉敏， 等. 人骨髓MSC对PHA活化T细胞周期以及表型和细胞因子分泌的影响［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23(5): 402-405.
［5］ Cooper S. Reappraisal of serum starvation， the restriction point， G0 and G1 phase arrest points［J］. FASEB J， 2003， 17(3): 333-340.
［6］ 宋今丹. 医学细胞生物学［M］. 北京: 人民卫生出版社， 2001: 175-187.