重组人次级淋巴组织趋化因子（SLC）体外活性的研究

　　　　 作者：刘明学， 尹长城， 春雷， 李琼芳， 黄华樑

【摘要】 目的: 对原核表达系统E.coli中表达的SLC进行体外活性的研究， 为进一步的体内实验和临床应用提供参考。方法: 采用Boyden小室测定趋化活性。结果: 对含有pALMSLC质粒的E.coli菌株进行诱导表达， 产物经SDSPAGE鉴定， 表达产物以可溶蛋白为主， 相对分子质量(Mr)在20 000左右。采用表达产物进行趋化性测定结果表明， 此蛋白对新鲜分离的外周血淋巴细胞具有明显的趋化作用， 其浓度为4～6 μg/L时对淋巴细胞的趋化指数最高可达2.3， 与国外报道相比， 趋化作用有效浓度更低。结论: 获得了具有生物学功能的重组SLC蛋白。

【关键词】 次级淋巴组织趋化因子; 体外活性; 趋化作用

　　次级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoidtissue chemokine， SLC)是全长134个氨基酸的高度碱性的CC亚族趋化因子。SLC是一种介导T细胞进入外周淋巴器官的趋化因子， 同时对成熟树突状细胞 (dendritic cell， DC)、 B淋巴细胞也有强的趋化能力［1］。对SLC的抗肿瘤活性研究表明其具有良好的应用前景。Sharma等［2］发现在肿瘤内注射重组的SLC可消除40%的实验鼠的肺癌肿瘤。马飞等［3， 4］研究发现SLC 基因转染并没有降低细胞的致瘤性， 但是移植瘤的生长明显慢于野生型恶性黑色素瘤细胞移植瘤的生长。因此认为SLC 基因转染小鼠黑色素瘤能诱导抗肿瘤免疫。Qin等［5］将人前列腺特异的细胞膜抗原 (hPSM)， 鼠前列腺酸性磷酸酶(mPAP)， 人前列腺特异抗原(hPSA)DNA片段连接在一起形成3P基因。然后把SLC， 3P和人IgG Fc基因插入到pcDNA3.1 形成一DNA疫苗， 称为pSLC3PFc。接种后DNA被细胞吸收并产生SLC3PFc融合蛋白， 其可以产生强的抗肿瘤反应。Liang等［6］利用腺相关病毒重组载体（rAAVSLC）进行肝细胞癌治疗动物实验， 发现rAAVSLC能够明显的抑制肿瘤生长。He等［7］的实验表明SLC与IL2和GMCSF联合使用时可诱发强大的抗肿瘤免疫反应。另外还发现SLC在损伤修复及肿瘤转移中起重要作用［8， 9］。本研究前期采用重叠PCR的方法合成了全长的人SLC DNA片段， 并构建了表达载体， 经诱导表达及Western blot鉴定， 确定所表达蛋白即为目的蛋白［10］。在此研究中对表达蛋白进行体外活性的研究， 为进一步的体内实验和临床应用奠定基础。

1 材料和方法

　　1.1 材料 pALMSLC质粒载体由本试验室构建; NiNTA购自NAVOGEN公司; rhSLC标准品购自R&&D System 公司; 淋巴细胞分离液购自华美公司; Baso刘氏染料购自珠海Baso公司; 其余常用试剂均为国产或进口分析纯。12孔趋化性测定板(12well chemotaxis plate )购自Neuro Probe， Inc 公司; 5 μm孔径无PVP聚碳酸酯膜（Polyvinylpyrrolidonefree filter）购自Neuro Probe， Inc公司; CO2培养箱为Forma Scientific产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 质粒pALMSLC在GI724中的表达 将含有SLC基因的重组质粒pALMSLC， 转化大肠杆菌GI724， 挑取单克隆菌30℃过夜培养， 次日以1∶50的比例接种于50 mL RM培养基中30℃放大培养， 然后以1∶50的比例转接于2 L RM培养基中， 于30℃生长至A600=0.5～0.7， 再以1∶100的比例加入Trp于37℃诱导表达4 h后， 离心收集菌体。在收获的菌体中加入适量的超声缓冲液用高压细胞破碎仪（600bar）破碎菌体。高速离心（8 000 r/min， 离心40 min）分离上清和沉淀备用。上清用NiNTA亲和层析。

　　1.2.2 趋化性测定 外周血淋巴细胞分离: 采用淋巴细胞分离液密度梯度离心分离。聚碳酸酯膜的预处理: 在聚碳酸酯膜面向趋化物质的一面覆盖上5 g/L四型胶原蛋白。趋化活性测定采用Boyden小室法， 简述如下: (1)在趋化性测定板底板每孔加入 160 μL不同浓度的待测液及对照， 在本研究中， 用PBS稀释样品， 因此采用PBS作为对照; (2)在上层板每孔加满细胞液（130 μL）， 细胞总量约105; 将加了细胞液的趋化性板在37℃含5 mL/L CO2， 饱和水汽二氧化碳培养箱中孵育3 h; (3)孵育结束后用吸水纸吸去上孔的培养液， 取下滤膜， 固定两侧后在清水中漂洗没有迁移细胞的一面， 再用橡皮刷轻轻刷去没有迁移的细胞; (4)将滤膜的光面向上置于载玻片上， 用700　　mL/L甲醇固定10 min， 用Baso刘氏染料染色， 将膜放在玻片上晾干， 在高倍镜下进行细胞记数， 随意选取5个视野， 计数细胞个数， 然后求每个视野的平均细胞个数; (5)趋化指数（chemotactic index， CI）的计算: 趋化指数CI=迁移到待测样品孔细胞数/迁移到对照孔的细胞数。

2 实验结果

　　2.1 重组人SLC在原核系统中的表达 pALM是由pAL781改造来的， 含PL启动子， 将SLC序列克隆至pALM载体中后， 经PCR鉴定， 阳性克隆经测序分析， 正确的克隆转化GI724， 依常规程序在30℃诱导表达， 电泳结果如图1所示， 可见表达产物以可溶蛋白为主， 相对分子质量（Mr）20 000左右。亲和层析纯化后电泳结果表明纯化产物纯度达到90%以上。

　　图1 SLC在E.coli中表达的电泳结果

　　1， 2: 分别为空载体的上清和沉淀; 3， 4: 分别为含pALMSLC质粒菌体的上清和沉淀; M: 相对分子质量标记; ←: SLC.

　　2.2 重组人SLC标准品的趋化结果 为了比较本研究中表达的SLC的体外活性作用， 采用R&&D公司生产的rhSLC作为阳性对照， 以SLC的稀释溶剂PBS和BSA（牛血清白蛋白）作为阴性对照， 从统计的结果来看rhSLC对淋巴细胞趋化指数较高， 而对单核细胞和多形核细胞几乎没有趋化作用。细菌内毒素LPS可以激活巨噬细胞， 诱导单核细胞等产生细胞因子［11］， 为了排除SLC的活性是由细菌内毒素LPS引起的， 做了LPS的趋化性实验。实验结果表明LPS对单核细胞远较对淋巴细胞和多形核细胞趋化性强， 其对单核细胞的最大趋化指数在10～100 mg/L之间。

　　2.3 样品的趋化结果 对含pALMSLC质粒的E.coli菌体进行高压细胞破碎， 离心分离沉淀和上清， 对上清采用NiNTA亲和层析纯化。上清与纯化样品在趋化活性上相比较， 在总细胞趋化指数上两者相差不大; 纯化样品对淋巴细胞的趋化指数比上清对淋巴细胞的趋化指数高3～5倍; 纯化样品对单核细胞和多形核细胞几乎没有趋化活性， 但上清对这两类细胞的趋化指数都在4～15之间。

　　2.4 趋化活性的最佳浓度结果 由于趋化因子作用浓度极低， 为了确定SLC趋化作用的最佳浓度， 于是设计了梯度稀释实验。从图2可看出， SLC对PBL的最大趋化活性在0.004～0.006 mg/L之间。方差分析数据都具有统计学意义（P&<0.05）。

　　图2 纯化SLC对外周血淋巴细胞的趋化活性结果

　　3 讨论

　　趋化因子最基本的功能是引起特定细胞的趋化运动， 但只有一定剂量范围的趋化因子才有趋化作用。对其活性的检测可采用体内和体外2种方法。体内实验较繁琐; 体外实验中最常用的方法是Boyden小室法。在用pALMSLC表达载体表达的SLC所做的实验发现上清与纯化蛋白趋化的细胞类型不同， 上清趋化的细胞类型中除了淋巴细胞外， 还含有大量的单核细胞和多形核细胞， 但纯化蛋白趋化的细胞类型中几乎全是淋巴细胞。从数据统计来看， 其数据差异较大， 但都在均值附近， 从方差分析结果来看， P均&<0.05， 因此组间差异是明显的。为了确证SLC的功能所做的验证实验与对照实验， 其数据也都经方差分析， 结果显示: 各组实验中， 对单核细胞和多形核细胞的趋化指数方差分析结果都不具有明显性（P&>0.05）， 产生这一结果的原因是由于在各次实验中， 单核细胞与多形核细胞占总细胞数比例很小， 因此统计数据差异十分大， 从而导致组内均差很大。LPS对总细胞与淋巴细胞的趋化结果经方差分析没有差异明显性， 说明LPS对淋巴细胞没有趋化作用; 而阳性对照SLC对淋巴细胞的趋化结果数据组间差异有统计学意义（P&<0.05）， 即趋化活性是与浓度相关的。最后用纯化的SLC做浓度梯度实验， 所得数据具有统计学意义（P&<0.05）。

　　为了证明本研究所表达的SLC是有活性的， 把其趋化性与阳性重组SLC的结果相比较， 发现它们都对淋巴细胞具有强的趋化作用， 而对单核细胞和多形核细胞几乎没有趋化作用。细菌内毒素LPS可以激活巨噬细胞， 诱导单核细胞等产生细胞因子［11］， 为了排除本研究所表达的SLC的活性是由细菌内毒素LPS引起的， 本研究又做了LPS的趋化性实验， 发现LPS主要对单核细胞发生趋化作用， 对淋巴细胞的趋化作用不强。所以SLC的作用不是由LPS所引起的。从其他阴性与无关对照实验来看， SLC的作用不是细菌的一些组成成分发挥的作用， 而的确是SLC的趋化作用。综上所述， 可以认为本研究所表达的SLC是有趋化活性的。

　　从已发表的文章中所得出的数据来看［12］， SLC发挥体外的趋化活性的浓度一般都是在μg/L级， 从本研究的结果来看， 最大趋化活性在4～6 μg/L的水平， 这与他们的水平相一致， 但作用有效浓度更低， 例如， Nagira等［12］达到最大趋化指数时SLC作用浓度为15 μg/L。在用纯化的SLC做浓度梯度实验发现， 在浓度达到40～400 μg/L的浓度时， 趋化活性反而下降， 表现为抑制效果。这也与其他人的研究相一致。

参考文献

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