sIL15Rα与脾细胞孵育后对小鼠黑色素瘤细胞生长的免疫调节作用

　　　　　　作者：顾艳宏， 王榕生， 束永前， 徐强

【摘要】 目的: 研究可溶性IL15Rα与脾细胞共同孵育后对小鼠黑色素瘤细胞生长的免疫调节作用。方法: 制备小鼠脾细胞， 分成两组， 一组加入可溶性重组IL15Rα (sIL15Rα)， 另外一组不加， 培养48 h后， 分离两组的贴壁细胞和非贴壁细胞， 流式细胞术(FCM)分析CD4、 CD8、 B220、 CD11c、 CD1a的表达; 并把上述4组细胞（即脾细胞非贴壁细胞组， 脾细胞贴壁细胞组， 脾细胞+sIL15Rα非贴壁细胞组， 脾细胞+sIL15Rα贴壁细胞组）和黑色素瘤细胞一起分别注射到小鼠腹部皮下， 观察小鼠腹部皮下肿瘤生长抑制情况， 对照组只注射小鼠黑色素瘤细胞。结果: 脾细胞+sIL15Rα贴壁细胞组小鼠黑色素瘤的生长速度显著小于其他各组; FCM分析， 此组细胞主要成分可能为树突状细胞（DC）。 结论: sIL15Rα与脾细胞共同孵育后， 可能通过DC的作用， 对黑色素瘤的生长进行免疫调节， 从而抑制瘤细胞的生长。

【关键词】 sIL15Rα; IL15; 树突细胞; 黑色素瘤

　　IL15 属于IL2家族， 它与IL2共用β和γ受体进行信号传导， 但同时又拥有自己独特的α受体， 是与IL2功能有所不同的一种T 细胞生长因子［1］。在生理条件下， IL15与膜上的IL15Rα结合， 但一般认为， 只有在出现IL2/15Rβ和γc时， 才能进行信号传导［2］。IL15Rα分布广泛， 在很多组织和细胞都能被检测出来， 例如脑、 肠、 肝、 外周血单核细胞（PBMC）等。它在体内以两种形式存在， 一种是膜型， 一种是可溶型， 可通过自分泌、 内分泌、 旁分泌或近分泌形式作用于靶器官和组织。其中， 可溶型的IL15Rα（sIL15Rα）相对分子质量（Mr）为42 000， 在生理条件下， 很低的浓度（pmol/L）就能与IL15有很高的亲和力。现在认为， 这种sIL15Rα是锚在膜上的IL15Rα通过金属蛋白酶水解后脱落的， 它可以阻断IL15与细胞膜表面受体的连接， 抑制IL15的作用。因为sIL15Rα对IL15有高亲和力， 有假说认为， sIL15Rα可能扮演一种类似分子清洗物的作用来去除多余的IL15; 当然， 它们之间的这种高亲和力的结合也许还起到其他作用， 目前仍不清楚［3， 4］。本实验中， 我们把sIL15Rα与脾脏细胞共同孵育后， 进一步研究其对小鼠黑色素瘤生长的影响。1 材料和方法

　　1.1 材料 6～8周龄的雄性C57BL/6小鼠， 质量22～25 g购自扬州大学实验动物中心。饲养温度为25℃左右， 光照周期为光照12 h， 黑暗12 h（12L: 12D）， 自由采食、 饮水。小鼠黑色素瘤细胞（B16）为本实验室长期拥有， 培养于RPMI1640培养液中， 含100 mL/L新生小牛血清， 10万U/L的青霉素/链霉素(INVITROGEN)。CD4、 CD8、 B220、 CD1a、 CD11c单克隆抗体（mAb）均购自美国BD公司。小鼠IL15、 IL2、 IFNγ ELISA试剂盒购自R&&D 公司。可溶性重组IL15Rα/Fc嵌和体(sIL15Rα) 购自R&&D 公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小鼠脾细胞的制备 拉颈椎处死小鼠， 无菌条件下取出脾脏， 放入盛有 RPMI1640完全培养液的平皿中， 研磨， 过滤， 获得粗制的脾细胞悬液; 4℃低速离心1 000 r/min， 5～10 min， 弃上清， 重悬细胞， 加入预冷TrisNH4Cl红细胞裂解液1 mL， 轻轻吹打混匀， 室温静置1～2 min， 溶解红细胞; 加5 mL RPMI1640完全培养液终止反应， Hank’s液洗2次， 最后将沉淀细胞重悬于2 mL RPMI1640完全培养液中; 细胞计数及测定存活率。

　　1.2.2 FCM检测 把上述制备的小鼠脾细胞， 分成两组， 一组加入可溶性重组IL15Rα(sIL15Rα)， 另外一组不加， 培养48 h后， 分离两组的贴壁细胞和非贴壁细胞， 用FCM分析其组分。即把上述4组细胞: 脾细胞非贴壁细胞组（SC NA）， 脾细胞贴壁细胞组（SC AD）， 脾细胞加入IL15Rα非贴壁细胞组（SC+sIL15Rα NA）， 脾细胞加入IL15Rα贴壁细胞组（SC+sIL15Rα AD）， 分别用PBS洗涤2次， 将细胞重悬于PBS中， 加入抗CD4PE、 CD8PE、 CD11cPE、 CD1a、 B220PE。充分混匀， 置4℃黑暗中孵育30 min， PBS洗涤2次后， 用FCM检测。

　　1.2.3 动物实验 共60只小鼠， 分5组。第1组为对照组， 注射小鼠黑色素瘤细胞， 其余4组分别注射上述培养48 h后分离的细胞（即SC NA、 SC AD、 SC+sIL15Rα NA、 SC+sIL15Rα AD）和小鼠黑色素瘤细胞的混悬液。具体如下: 用750 mL/L乙醇消毒小鼠腹部皮肤， 用注射器吸取上述细胞悬液0.2 mL（5×105）， 接种于小鼠腹部皮下。接种1周后， 用游标卡尺测量肿瘤结节的最长径a和最短径b， 根据公式计算肿瘤体积 (V)［5］， V=a×b2/2， 求其平均值绘制肿瘤生长曲线。并根据不同时间段绘制无瘤小鼠的百分比曲线， 以评价各组小鼠肿瘤生长情况。

　　1.2.5 统计学分析 采用SPSS10.0软件分析数据， 两两比较采用Student’s t检验， 以P＜0.05为差异有统计学意义。流式细胞仪采用CellQuest软件获取， WinMDI2.8分析。

　　2 结果

　　2.1 细胞表型分析 SC NA与SC+sIL15RαNA组细胞表型分析: CD11c、 CD1a表达阴性， CD4、 CD8、 B220表达阳性， 提示其主要成分为T、 B细胞。SC AD组与SC+sIL15RαAD组， CD11c、 CD1a表达阳性， CD4、 CD8、 B220表达阴性， 提示其主要组分可能为树突状细胞（图1）。

　　2.2 小鼠黑色素瘤的生长抑制情况 对照组肿瘤生长速度最快， 其次为SC NA组 和SC+sIL15RαNA组， 再其次为SC AD组， SC+sIL15RαAD组肿瘤生长速度最慢。SC+ sIL15RαAD组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05， 图2）。

　　2.3 不同时间段无瘤小鼠的百分比 对照组从第20天开始小鼠均出现肿瘤， 无瘤百分比为0; SC NA（图3A）组在第27天有6只小鼠出现肿瘤， 第39天时共有9只小鼠出现肿瘤; SC+sIL15Rα NA组（图3B）在第20天3只小鼠出现肿瘤， 第27天时共有6只小鼠出现肿瘤; SC AD组（图3C）在第27天有3只小鼠开始出现肿瘤; SC+sIL15RαAD组（图3D）直到第35天才开始有3只小鼠出现肿瘤。各组无瘤小鼠的百分比情况基本跟肿瘤的生长抑制情况一致。其中SC+sIL15RαAD组无瘤小鼠的百分比最高。

　　3 讨论

　　IL15是一个对原发性和过继性免疫都非常重要的多效性细胞因子。IL15Rα作为IL15的独特型受体， 对IL15而言是非常重要的。在本实验中使用的sIL15Rα是与IL15具有高亲和力的的重组IL15Rα/Fc的嵌合体， 其Mr为42 600， 与IL15结合后， 能竞争性抑制IL15与膜上IL15Rα受体的连接［6］， 已经成为研究可溶型IL15Rα的工具。

　　实验中显示， 当把对IL15有高亲和性的可溶型的IL15Rα和脾脏细胞共同培养后与小鼠黑色素瘤细胞一起种植到小鼠皮下， 其中SC+sIL15RαAD组出现肿瘤的时间最晚， 肿瘤的生长速度最慢， 分析其组分发现， 其主要成分可能为DC， 同样SC AD组细胞表型与其相同。DC是体内非常重要的一种高度特异性抗原递呈细胞， 在免疫系统中起着非常重要的作用。为什么两者的细胞表型相同， 但对小鼠黑色素瘤的抑制情况却不同呢？我们考虑主要是sIL15Rα的作用， 在培养48 h后， sIL15Rα可以与脾细胞中各种细胞分泌的IL15相结合， 从而能竞争性抑制IL15与膜上IL15Rα受体的连接［6］， 使得DC膜上的IL15Rα可能得以保存。当把这种细胞和黑色素瘤细胞一起注射到小鼠体内时， DC细胞表面的IL15Rα能够递呈IL15给邻近的细胞， 例如NK细胞， CD8+细胞， 启动它们分泌细胞因子和细胞毒效应， 来杀伤肿瘤细胞［7］。而SCAD组， DC膜上的IL15Rα被IL15结合， 不能起到递呈作用， 所以效果不显著。而在其他两组， sIL15Rα NA和SC NA组， 由于缺乏DC的作用， 不能启动小鼠体内的免疫监视， 导致肿瘤生长速度较快。各组无瘤小鼠的百分比跟上述结果一致， 生长速度最快的对照组， 无瘤小鼠的百分比最低， 生长速度最慢的SC+sIL15RαAD组， 无瘤小鼠的百分比最高。

　　本实验中我们进一步揭示了可溶型IL15Rα在IL15作用机制中的重要性， 它与脾细胞共同孵育后， 可能通过DC的作用发挥免疫调节作用， 从而抑制小鼠黑色素瘤的生长。可溶型的IL15Rα将来也许能成为一个有前景的药物， 特别是对肿瘤的免疫治疗方面， 可能起到更重要的作用。

参考文献

［1］ Cornish GH， Sinclair LV， Cantrell DA. Differential regulation of Tcell growth by IL2 and IL15［J］. Blood， 2006， 108(2): 600-608.

［2］Stoklasek TA， Schluns KS， Lefrancois L. Combined IL15/IL15Ralpha immunotherapy maximizes IL15 activity in vivo［J］. J Immunol， 2006， 177(9): 6072-6080.

［3］ GironMichel J， Giuliani M， Fogli M， et al. Membranebound and soluble IL15/IL15R complexes display differential signaling and functions on human hematopoietic progenitors［J］. Blood， 2005， 106: 2302-2310.

［4］ Rubinstein MP， Kovar M， Purton JF， et al. Converting IL15 to a superagonist by binding to soluble IL15R［J］. PNAS， 2006， 103: 9166-9171.

［5］ Schiffer IB， Gebhard S， Heimerdinger CK， et al. Switching off HER2/neu in a tetracyclinecontrolled mouse tumor model leads to apoptosis and tumorsizedependent remission［J］. Cancer Res， 2003， 63: 7221-7231.

［6］ Bernard J， Harb C， Mortier E， et al. Identification of an interleukin15alpha receptorbinding site on human interleukin15［J］. J Biol Chem， 2004， 279(23): 24313-24322.

［7］ Sato N， Patel HJ， Waldmann TA， et al. The IL15/IL15R on cell surfaces enables sustained IL15 activity and contributes to the long survival of CD8 memory T cells［J］. PNAS， 2007， 104: 588-593.ISSN1007-8738