血管紧张素(17)对转化生长因子β1诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

　　　　 作者：贺红焰 何进， 李隽， 王明勇， 刘建

【摘要】 目的: 研究血管紧张素(17)［Ang(17)］对转化生长因子β1(TGFβ1)诱导的大鼠肾小球系膜细胞（GMC）增殖的影响并初步探讨其机制。方法: 采用WST法检测培养系膜细胞增殖; RTPCR法检测细胞内信号传递分子Smad3/7基因mRNA的表达。结果: 与对照组比较， Ang(17)明显抑制TGFβ1诱导的GMC增殖（P&<0.05）; 同时， Ang(17)对TGFβ1诱导的系膜细胞内Smad3， Smad7基因mRNA表达有明显的抑制作用（P&<0.05）。结论: Ang(17)对TGFβ1诱导的系膜细胞增殖有抑制作用， 其机制可能是通过下调细胞内信号传递分子Smad3/7的表达。

【关键词】 系膜细胞; 血管紧张素(17); 转化生长因子β1; 细胞增殖; Smad3/7

　　转化生长因子β1(transforming growth factorβ1， TGFβ1)是目前公认的最强的致纤维化作用的细胞因子， 在促进肾小球病变发生、 发展过程中起着重要的作用， 如调节肾小球固有细胞增殖、 促进细胞外基质(extracellular matrix， ECM)合成和分泌、 改变基质降解酶及其抑制因子的表达量和活性等。肾小球系膜细胞(GMC)是肾小球内一种固有的血管外周细胞， 大量实验研究证实， 该细胞的异常增殖在肾小球病变进展过程中起着重要的作用， 而TGFβ1对GMC具有明显的促增殖作用。血管紧张素(17) ［Angiotensin（17）， Ang(17)］是肾素血管紧张素家族中被新认识的一个重要成员， 国内外大量的实验以及我们既往的研究均证实Ang(17)可抑制AngⅡ、 内皮素1等多种因素引起的包括GMC在内的多种细胞增殖以及ECM的分泌［1， 2］， 但它对TGFβ1所诱导的GMC增殖的影响尚无相关报道。我们研究Ang(17)对TGFβ1诱导的大鼠系膜细胞增殖及其对细胞内信号传递分子Smad3/7的影响， 旨在探讨Ang(17)对肾脏纤维化的影响及可能的作用机制， 为慢性肾脏疾病的防治提供新的思路和理论依据。

1 材料和方法

　　1.1 材料 大鼠肾小球系膜细胞购自武汉大学保藏中心; Ang(17)、 TGFβ1均购自美国Sigma公司; WST试剂盒购自碧云天生物技术有限公司， Smad3/7以及大鼠βactin引物由上海生工合成; RTPCR试剂盒由成都博瑞克生物技术有限公司提供; Taq酶由北京天根公司提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 GMC的培养 复苏细胞后将其加入RPMI1640培养液， 接种于培养瓶中， 放入培养箱中。至细胞长至亚融合状态．用2.5 g/L胰酶消化， 传代， 取生长旺盛的细胞做实验。

　　1.2.2 WST检测活细胞数目 将培养的大鼠肾小球系膜细胞用无血清的RPMI1640培养液制成（5～10）×107/L的细胞悬液， 接种在96孔板中， 每孔加入细胞悬液100 μL， 无血清培养24 h， 使其生长同步化， 当细胞生长融合至70%左右时加入干预因素， 药物干预24 h后， 每孔加入WST 100 μL， 37℃继续孵育4 h， 终止培养， 在酶联免疫检测仪上测定A490值， 用只加培养液不加细胞的空白孔调零。

　　1.2.3 Smad3/7mRNA表达测定 按说明书提取GMC总RNA， 逆转录为cDNA后进行PCR反应。扩增大鼠Smad3的引物序列为: 上游引物: 5′ACA GCA TGG ACG CAG GTT CT3′， 下游引物: 5′TCA CTG AGG CAC TCC GCA AA3′， 扩增片段长337 bp; 扩增大鼠Smad7的引物序列为: Smad7上游引物: 5′GGA GTC CTT TCC TCT CTC3′， 下游引物: 5′GGC TCA ATG AGC ATG CTT CAC3′， 扩增片段长125 bp， 扩增大鼠βactin 上游引物: 5′CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCT G3′， 下游引物: 5′GGA GCA ATG ATC TTC ATC TTC3′， 扩增片段长205 bp）， PCR反应共35个循环， 取产物15 μL于15 g/L琼脂糖凝胶中电泳， 用凝胶成像扫描及分析系统， 测定目的基因与内参基因的积分光密度比值， 用ＳＰＳＳ软件进行分析。

　　1.2.4 实验分组 (1)对照组（A组）: 不加入任何干扰因素; (2) TGFβ1作用组（B组）: 在培养液中加入TGFβ1（终浓度5 μg/L）; (3)Ang(17)组（C组）: 在培养液中加入Ang(17)（终浓度10-6 mol/L）; (4)TGFβ1+ Ang(17)组（D组）: 浓度同上。每组均为5个样本， 在96孔板中培养。药物干预时间均为24 h。

　　1.2.5 统计学分析 实验结果用x±s表示， 采用单因素方差分析（F检验和q检验）进行组间比较， P&<0.05表示差异有统计学意义。采用SPSS13.0软件进行统计学分析。

2 结果

　　2.1 Ang(17)对TGFβ1诱导GMC增殖的影响 与对照组相比， TGFβ1（5 μg/L）可明显促进GMC增殖(P&<0.05); Ang(17)（10-6 mol/L）明显抑制GMC增殖(P&<0.05); 同时Ang(17)组+TGFβ1的促细胞增殖作用也有明显抑制作用（P&<0.05， 表1）。 表1 Ang(17)对TGFβ1诱导GMC增殖的影响

　　2.2 Ang(17) 对TGFβ1诱导的肾小球系膜细胞smad3基因表达的影响 图1为smad3基因mRNA表达量变化的电泳图。经过凝胶成像分析， 与对照（A）组相比， B组TGFβ1（5 μg/L）可明显促进GMC Smad3 mRNA的表达 (P&<0.05); C组Ang(17)（10-6 mol/L）明显抑制Smad3 mRNA的表达（P&<0.05); 而Ang(17)+TGFβ1（D组）所诱导的Smad3表达也有明显的抑制（P&<0.05， 图2)。

　　2.3 Ang(17)对TGFβ1诱导的肾小球系膜细胞smad7基因表达的影响 图3为smad7基因mRNA表达量变化的电泳图， 经过凝胶成像分析， 与对照(A)组相比， B组TGFβ1（5 μg/L）可促进GMC Smad7 mRNA的表达 (P&<0.05); C组Ang(17)(10-6 mol/L）对Smad7 mRNA的表达无统计学意义（P&>0.05); 但Ang(17)+TGFβ1（D组）所诱导的Smad7的表达却有明显的抑制作用（P&<0.05， 图4)。图3 Smad7基因mRNA表达量变化的电泳图

　　3 讨论

　　肾脏纤维化是各种原因所致的终末期肾病的共同表现， 包括了肾小球硬化和肾小管间质纤维化， 是以ECM的过度积聚和沉积为特征的过程。研究发现TGFβ1可通过激活细胞内Smad蛋白通路引起肾小球的硬化［3］。Ang(17)是RAS家族的一个新成员， 具有扩管降压及调节水盐平衡等作用， Freeman等［4］首次发现Ang(17)对胎牛血清、 血小板衍生生长因子、 AngII的促平滑肌细胞生长作用具有明显的抑制作用， 并在胎牛血清所诱导的平滑肌细胞增殖中进行了量效研究， 发现Ang(17) (10-10～10-6 mol/L)呈剂量依赖性抑制胎牛血清的促平滑肌细胞增殖作用。Tallant等［1］研究也发现Ang(17)可明显抑制胎牛血清以及内皮素1诱导的新生大鼠心肌细胞肥大和心脏成纤维细胞增殖。我们以前的研究也发现Ang(17)可呈剂量依赖性抑制AngⅡ诱导的GMC增生以及HA（透明质酸）及PCⅢ（Ⅲ型前胶原）等细胞外基质的分泌［2］。目前Ang(17)对TGFβ1所致纤维化抑制作用的研究还较少， 现有的一些发现表明Ang(17)可通过抑制胞外信号调节激酶（ERK1/2）， P38， JNK等的磷酸化来发挥抑制作用［5， 6］， 但它能否通过对TGFβ/Smad通路的抑制来拮抗TGFβ1的致纤维化作用还未可知。最近有国外研究发现Ang(17)在改善心肌重塑的同时可降低血浆中TGFβ的水平［7］， 而我们此次的研究证实， Ang(17)对基础状态下以及TGFβ1诱导下的肾小球系膜细胞的增殖均有抑制作用， 表明Ang(17)对TGFβ1致纤维化效应具有直接的抑制作用。近年来国外研究证实， Smad蛋白家族是TGFβ1细胞内信号转导过程中极其重要的介导分子［8］。TGFβ1与其受体结合后使Smad2、 3蛋白中的丝氨酸磷酸化（此步骤可被抑制性的Smad7所抑制）， 磷酸化的Smad2， 3蛋白与Smad4蛋白结合转运到细胞核， 调节相关基因的转录。研究发现在体外培养的GMC中不仅有Smad2、 Smad3和Smad4蛋白， 而且它们可被TGFβ1激活并且参与了Col I等ECM的转录过程， 同时还可促进GMC基础性及经TGFβ1刺激后早期PAI1基因的表达， 当使用选择性Smad通路阻断剂SB 505124后能抑制TGFβ1诱导的ECM合成［3， 9］表明Smad通路在TGFβ1的致纤维化机制中起着重要的作用。我们的研究发现Ang(17)可抑制TGFβ1诱导的细胞内正性信号传递分子Smad3 mRNA的表达， 同时对其负性信号传递分子Smad7 mRNA的表达也有抑制作用， 说明Ang(17)对TGFβ1的抑制机制可能是通过对正性Smad分子的抑制来实现的， 而并非是促进负性信号传递分子的表达。

参考文献

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