DcR3对人肺成纤维细胞合成Ⅳ型胶原的作用

　　 作者：杨洋， 乔俊华， 安继红， 张越， 吴春风， 郏博， 马忠森

【摘要】 目的: 探讨诱骗受体3（DcR3）对人肺成纤维细胞（HLF）合成Ⅳ型胶原的作用。方法: OverPCR方法构建DcR3的真核表达载体， 脂质体法转染HLF细胞， Western blot检测HLF细胞合成Ⅳ型胶原的含量。结果: 成功构建了pvax1DcR3真核表达载体并转染HLF细胞; 转染组细胞Col Ⅳ表达量明显升高， 从12 h开始持续到72 h， 与对照组比较差异有统计学意义（P&<0.01）; 而转染+抗体组与对照组比较差异无统计学意义（P&>0.05）; 转染组不同时间Col Ⅳ表达量有统计学意义（F=34.25， P&<0.05）。结论: DcR3促进HLF细胞合成Ⅳ型胶原的能力， 可能是加速肺纤维形成的因素之一。

【关键词】 DcR3基因; HLF; Ⅳ型胶原

　　诱骗受体3 (decoy receptor 3， DcR3)是一个新发现的具有免疫抑制作用的分子， 与多种自身免疫性疾病、 肿瘤、 弥漫性肺间质疾病等相关［ 1， 2 ］。有文献报道DcR3在肺纤维化患者外周血单核细胞中高度表达［3］， 但是DcR3在肺纤维化的发病过程中， 到底扮演怎样的角色， 目前尚不明确。本研究拟通过检测分析转染DcR3后， 肺成纤维细胞合成Ⅳ型胶原的能力， 探讨DcR3对肺纤维化形成的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 人肺成纤维细胞（human lung fibroblast， HLF）购自上海细胞研究所。真核表达质粒pvax1购自天根公司; 原核表达质粒pET28a（+）DCR3（含酶切位点BamH I和EcoR I）， 为本室构建并保存。Mouse anti human DcR3自备。小鼠抗人Col Ⅳ单克隆抗体(mAb)和相应二抗及DAB显色液购自武汉博士德生物试剂公司。PCR引物、 Primer STARTM HS DNA Polymerase、 DH5αE.coli感受态细胞、 DNA 连接酶、 限制性内切酶BamH I和EcoR I、 核酸分子质量标准、 购自天根公司; LipofectamineTM2000脂质体、 细胞培养试剂购自Invitregen公司; 质粒抽提试剂盒购自美国Promega公司; PVDF膜购自Roche公司， RPMI1640 培养基细胞培养试剂购自Sigma 公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计与合成 参考GenBank 收录的DcR3序列和信号肽序列（AF104419）， 设计引物如下: A1: 5′CGGATCCAGCATGGCCCTGTGGATGCGCC3′（斜体为BamH I酶切位点）; A2: 5′CAGGGGTAGGTGGGTGTTTCTGCCACGGCTGCGGCTGGGTCAGGTC3′; B1: 5′GACCTGACCCAGCCGCAGCCGTGGCAGAAACACCCACCTACCCCTG3′; B2: 5′CCGAATTCTCAGTGCACAGGGAGGAAGCG3′（斜体为EcoR I酶切位点）上述引物由上海生工生物工程公司合成并纯化。

　　1.2.2 PCR 扩增人DcR3cDNA 通过overlap PCR方法将信号肽和目的基因相连， 扩增出完整的DcR3cDNA。具体如下: 以含信号肽质粒为模板， 以A1、 A2为引物扩增信号肽序列; 以含目的基因质粒为模板， 以B1、 B2为引物扩增目的基因; 以1和2步骤中产物为模板， 以A1和B2为引物扩增即得到含信号肽的目的基因序列。循环条件为: 94℃ 45 s， 63℃ 90 s， 72℃ 1 min， 共进行35个循环， 最后一个循环72℃延伸10 min。

　　1.2.3 DcR3重组质粒的构建和鉴定 TaKaRa 胶回收试剂盒回收PCR 产物。提取质粒载体pvax1， 然后用BamH I和EcoR I对质粒和纯化后的PCR产物分别进行双酶切。酶切产物用TaKaRa胶回收试剂盒回收， 紫外分光光度计上测定载体和PCR两种双酶切产物量。然后按10∶1 (DcR3∶pvax1)的摩尔比混合， 16℃连接反应过夜。将连接产物转化感受态DH5α， 氨苄平板筛选。取阳性单克隆进行扩增， 抽提重组pvax1DcR3质粒进行BamH I和EcoR I双酶切， 然后在20 g/L琼脂糖凝胶上电泳鉴定目的片段是否插入。鉴定正确的克隆送上海生工生物公司测序。

　　1.2.4 HLF细胞培养 HLF细胞培养采用100 mL/L FCS培养液和条件培养液联合培养（1∶1）。条件培养液制备: 取5只2周龄博莱霉素法制备的大鼠肺纤维化模型， 用9 mL/L生理盐水灌洗肺脏(1.5 mL/次×4 次) ， 收集灌洗液， 1 000 r/min 离心10 min， 弃上清， 将沉淀细胞用含100 mL/L FCS 的RPMI1640培养液于50 mL/L CO2 培养箱37℃培养2 h ， 使巨噬细胞贴壁。改用含2 mL/L FCS 的培养液(5 mL/瓶) 继续培养24 h， 收集上清作为条件培养液［4］。

　　1.2.5 pvax1DcR3 转染HLF细胞 采用LipofectamineTM2000脂质体转染， 将质粒4 μg/孔用500 μL无双抗、 无血清的RPMI1640培养液稀释; 将10 μL脂质体用500 μL无双抗、 无血清的RPMI1640培养液稀释， 静置5 min; 混合DNA和脂质体， 室温放置20 min; 细胞用1×PBS洗2遍， 加400 μL无双抗、 无血清RPMI1640培养液; 将DNA和脂质体混合物逐滴加至细胞上， 轻轻摇匀， 37℃孵育; 4 h后换成含联合培养基继续培养。细胞分组: 转染组、 对照组、 转染＋抗体组。

　　1.2.6 Col Ⅳ胶原检测(Western blot) 细胞转染处理后， 于12、 24、 48、 72 h收集细胞， 提取细胞总蛋白， 制备75 g/L分离胶进行电泳， 每孔加蛋白20 μg ， 上样总体积20 μL， PVDF 转膜， 100 g/L脱脂奶粉封闭3 h ， 加入小鼠抗人Col ⅣmAb(1∶500稀释) ， 同时做βactin内参照; 4℃摇床过夜; 加入生物素标记的二抗(1∶4 000) ， 摇床常温孵育1 h ， X 光底片曝光， 显影及定影， 对电泳条带扫描及图像分析， 得出条带的平均吸光度(A) 。试验重复3 次。

　　1.2.7 统计学分析 数据以x±s表示， 采用SPSS13.0统计软件， 包括单因素方差分析和多组间两两比较的LSD检验。

　　2 结果

　　2.1 重组质粒pcDNA3.1(+)DcR3的双酶切鉴定 20 g/L的琼脂糖凝胶电泳结果显示， 重组质粒pvax1DcR3经BamH I和EcoR I双酶切， 可切出2个片段， 大片段迁移率与空质粒双酶切后的片段一致， 约为2 972 bp; 小片段迁移率与设计片段一致， 约为901 bp(图1)。

　　图1 pvax1DcR3酶切鉴定结果

　　M: DL 2 000 DNA marker; 1， 3: 质粒pET28a（+）DcR3; 2， 4: 经BamH I和EcoR I双酶切pvax1DcR3.

　　2.2 pcDNA3.1(+)DcR3重组载体测序及序列分析结果 DNA 测序结果显示， 重组质粒含有901 bp的目的基因片段， 读码框架正确， 无碱基错配及移码突变。

　　2.3 DcR3对HLF合成Col Ⅳ的促进作用 经Western blot检测(图2)和图像分析(电泳分离条带的平均吸光度A值) 证明， DcR3转染人肺成纤维细胞后， 转染组细胞Col Ⅳ表达量明显升高， 从12 h开始持续到72 h， 与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）; 而转染组+抗体组与对照组比较差异无统计学意义; 转染组不同时间Col Ⅳ表达量有统计学意义（F=34.25， P＜0.05， 表1）。说明DcR3的表达增强了HLF合成胶原的能力。

3 讨论

　　弥漫性间质性肺疾病（ILD）是肺内弥漫性成纤维细胞过度增生和细胞外基质过度沉积的一组疾病， 虽然引起ILD病因不同， 但其发病都从肺泡炎开始， 最终发展为肺间质纤维化。目前认为ILD发病的主要过程如下: 在不同病因作用下肺泡上皮和血管内皮及血液蛋白成分露出， 形成肺泡炎的初始阶段; 病变进一步发展使炎症细胞、 免疫效应细胞进入肺内并释放介质; 在前述细胞及释放介质的作用下， 成纤维细胞活化、 增殖及生成胶原和细胞外基质。肺内成纤维细胞活化的结果就是合成Ⅰ、 Ⅲ型胶原的能力增强， 胶原的沉积导致呼吸膜增厚直至取代肺泡组织［5］。

　　用博莱霉素制备的2周大鼠肺纤维化模型恰好是肺泡炎阶段， 我们利用这个阶段的大鼠肺泡灌洗液制备条件培养液， 就是为了模拟ILD发病的主要过程， 这样我们的结果更能具有指导临床的作用。前期工作中我们通过亚克隆的方法构建了重组原核表达质粒pET228a (+)/DcR3， 表达了DcR3蛋白并制备了mAb［6］。但是， 该质粒中 DcR3序列（825 bp）不含信号肽， 为了在HLF中表达这个基因， 我们用overPCR方法把信号肽连接到DcR3序列（825 bp）上， 构建了DcR3的真核表达载体pvax1DcR3。 pvax1DcR3转染HLF后 Col Ⅳ表达量明显升高， 从12 h开始持续到72 h， 与对照组比较差异有统计学意义（P&<0.01）; 而加入DcR3抗体后， 合成Col Ⅳ表达量就无明显变化， 与对照组比较差异无统计学意义; 说明就是DcR3增强了HLF合成胶原的能力， 促进了肺内成纤维细胞活化， 导致胶原沉积在呼吸膜， 加速了肺纤维化的形成。以此作为突破点， 近一步开发可用于临床的DcR3抗体， 也许可以成为将来肺纤维化治疗的新途径。

参考文献

［1］ You RI， Chang YC， Chen PM， et al. Apoptosis of dendritic cells induced by decoy receptor 3 (DcR3)［J］. Blood， 2007， 15(9): 2413-2418.

［2］ Ka SM， Sytwu HK， Chang DM， et al. Decoy receptor 3 ameliorates an autoimmune crescentic glomerulonephritis model in mice［J］. J Am Soc Nephrol， 2007， 18(9): 2473-2485.

［3］ 黄志卫， 马忠森， 王秀丽， 等. 外周血单核细胞DcR3基因过度表达在间质性肺疾病发病中的意义［J］. 中华结核和呼吸杂志， 2003， 26(5): 318-319.

［4］ Hirohisa K， Munetaka N ， Ichiro W. Effects of acute ethanol administration on LPS induced expression of cyclooxygenase2 and inducible nitric oxide synthase in rat alveolar macrophages［J］. Alcohol Clin Exp Res， 2005， 29(12): 285-293.

［5］ Gaenko GP， Khaidukov SV， Molotkovskii YG. Expression of type Ⅳcollagen by Lewis pulmonary carcinoma cells［J］. Bull Exp Biol Med， 2004， 137(4): 67-69.

［6］ 吴春风， 马忠森， 王秀丽， 等. 人DcR3融合蛋白的表达、 纯化及多克隆抗体的制备［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23 (12) 1160-1162.