细胞色素C/心磷脂复合体和氧化心磷脂及细胞凋亡

【关键词】 细胞色素C; 心磷脂

　　多年来， 认为脂质通过构成细胞膜疏水性核而保持其完整性; 但一直忽视了脂质其他重要功能， 尤其是信号机制。细胞内显著的多种类脂质和大量的特殊脂质分子种类不能简单地运用它们对适当膜流动性的保持是必须的观点加以解释［1］。最近发现脂质， 尤其是细胞信号中不同修饰的脂质， 在信号转导中的作用［2］。事实上， 膜脂质是许多合成的第二信使前身的来源， 常通过水解从父代脂质合成不同的信号分子。促成脂质分子种类多样性主要在于它们的脂肪酸残基与极性头部结构不同组合。哺乳动物中， 许多脂质含有多不饱和脂肪酸， 它们易被氧化。因此， 巨大数量脂质分子的氧化修饰也许存在。

　　1 线粒体中的心磷脂及其在凋亡早期局部含量的变化

　　线粒体中心磷脂(cardiolipin， CL)约占所有脂质的25%。真核细胞内心磷脂主要位于线粒体内膜(inner mitochondrial membrane， IMM)， 然而， 至少65%的CL存在于膜内侧从而形成了磷脂的主要成分。每个CL分子含有4个脂肪酸残基。因此， 在理论上有大量可能的CL分子种类。每个额外的对脂肪酸残基的修饰(如对多不饱和脂肪酸的过氧化)可以通过组合增加其数量。但令人惊讶的是， 许多可能的CL分子种类中仅有极少数存在于组织中。哺乳动物心脏CL主要含亚油酸(C18∶2)［3］， 而在一些海产双壳类的CL主要含二十二碳六烯酸(C22∶6)［4］。人类淋巴细胞中CL有多个脂肪酸， 其中包括油酸(C18∶1)和棕榈油酸(C16∶1) ［5］。鼠脑CL富含长链多不饱和脂肪酸残基， 如花生四烯酸(C20∶4)， 二十二碳四烯酸(C22∶4)和二十二碳六烯酸(C22∶6)［6］。

　　CL在程序性细胞死亡中起重要作用， 是tBid诱导的线粒体生物能学失稳过程中的主要因子。凋亡相关蛋白如Bid和tBid含CL结合域并显示出与CL及其代谢产物， 单和双溶血CL的动态作用［7］。这些作用在线粒体内膜和外膜作用位点可能是十分有效的， 可导致CL跨膜分布的改变和其微结构域的重组， 从而形成易于细胞色素c（cytochrome c， cyt c）和其他促凋亡因子释放的一个六边形Hn构象［6］。因此， 凋亡时CL可明显促进外膜通透性增高和cyt c的释放。正常细胞中， 约80%的CL存在于线粒体内膜， 其基质面和膜间隙表面的分布比例约为60∶40［7］。尽管有约70倍过剩的CL易与cyt c进行化学当量1∶1的结合， 但大部分CL不是游离［8］的而是与线粒体电子传递链复合体相互作用。然而凋亡细胞中， 线粒体外膜CL含量显著升高至约40%的水平。内膜两面的CL分布也发生改变， 外层几乎有70%的CL， 而30%仍局限于内层基质面。CL这种跨膜迁移出现于凋亡早期， 远远先于线粒体膜电位的改变和其他凋亡标记， 如质膜磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine， PS）外翻， 但晚于活性氧产生。凋亡时可与膜上cyt c紧密结合的CL数量发生了显著变化。凋亡时CL分布改变可能是由于其与tBid相互作用而改变。事实上， 额外的tBid体外加入小鼠肝线粒体中可导致内外膜上CL分布的显著变化和单溶血（monolyso）CL的集聚。此外低剂量外源性单溶血CL和tBid加入离体线粒体时， 可出现单溶血CL的集聚， 同时出现tBid线粒体跨膜迁移和cyt c的释放。

　　2 心磷脂与细胞色素c结合并改变其催化性质

　　生理条件下cyt c是一个带8个正净电荷的碱性蛋白。因此， 它易与负电荷膜包括阴离子(磷)脂膜相结合。该结合赋予了cyt c显著的过氧化酶活性。这是由于其部分展开以及血红素铁与Met80配位键弱化引起的。因此， 小分子如h3O2易接近cyt c亚铁血红素位点从而激活其过氧化物酶活性。线粒体cyt c/CL复合体过氧化物酶活性是CL特异的过氧化物酶， 可产生过氧化CL。

　　静息状态线粒体中大部分CL和cyt c在空间上是分离的， 因此， cyt c过氧化物酶活性很低。然而， 凋亡时大量CL跨膜迁移可形成cyt c/CL复合体并显著提高cyt c的过氧化物酶活性。事实上线粒体膜间可利用的cyt c的数量， 决定了凋亡时cyt c/CL复合体过氧化物酶水平， 而IMM外层和OMM内层的CL含量对此无重要影响。cyt c siRNA处理细胞可导致CL加氧酶水平的降低和与cyt c含量相称的对凋亡敏感性的降低。

　　因此凋亡时如果有足够水平的h3O2(与过氧化物酶的激活所需的量相当)， cyt c/CL复合体的过氧化物酶活性可产生CL过氧化物。凋亡时h3O2一个重要来源是电子传递链失调产生的高浓度超氧化物， 后者自发或通过MnSOD催化岐化可产生h3O2。此外， 与CL结合的cyt c有一个负的氧化还原电位， 妨碍了其参与电子传递链作为线粒体复合体III的电子受体。因此cyt c/CL复合体不能参与复合体III和IV间的电子传递。最近发现p66(正常情况下是酪氨酸激酶接头蛋白)可作为凋亡时h3O2的产生器， 从而产生足够的促氧化物促进CL的氧化［9］。因此， CL氧化可发生于各种细胞的凋亡时期。电离辐射是促凋亡刺激之一， 可触发显著的依赖cyt c水平的CL氧化。对小鼠心脏线粒体进行电离辐射可致CL氧化产物的积聚， 可代表过氧化CL总量和质谱分析中多不饱和过氧化CL分子种类数量的升高。据此损伤因素(脑创伤损伤后)致组织中细胞凋亡时， CL过氧化物的积聚可作为一个特征性的生物学标记。

　　3 促凋亡因子的释放需氧化CL的参与

　　CL氧化对于凋亡过程的意义在于该氧化磷脂对于促凋亡因子如Smac/Diablo， cyt c、 凋亡诱导因子（AIF）等释放是必须的［10］。cyt c缺失细胞中， CL氧化不能发生， 促凋亡因子也不能释放。此外， 外源性奇氯（ClOx）加入cyt c缺失细胞的线粒体中可促使促凋亡因子Smac/Diablo释放， 是在正常线粒体促凋亡机制中ClOx的重要作用。目前， 仍不清楚ClOx是否依赖或与其他促凋亡分子如Bax、 Bak关联来触发这些因子逸至胞质。因此， 两个促凋亡通路、 CL跨膜迁移和cyt c/CL复合体形成， 产生了一个新的信号， 即氧化的CL， 其对于促凋亡因子由线粒体释放至胞质是必须的。

　　4 心磷脂二十二碳六烯酸或亚油酸修饰对凋亡的影响

　　CL氧化是凋亡程序的早期事件， 刺激CL氧化可能会提高细胞的凋亡应答; 相反， 抑制CL氧化也可相应降低其对凋亡的敏感性。人工细胞中可检测到CL脂肪酸修饰可改变其对氧化的敏感性。现已证实四油酰CL(tetraoleoylCL)对cyt c催化的氧化高度耐受， 而四亚油酰CL和CL更多不饱和分子对促氧化刺激高度敏感。利用含有非常丰富CL分子的HL60细胞， 其中含有极易被氧化的C22∶6。这些细胞对十字孢碱的促凋亡刺激变得十分敏感。相反， 含高含量油酸和饱和脂肪酸残基CL的细胞对凋亡刺激有较高耐受。可以推测改变CL对氧化的敏感性也许是未分化细胞(如神经干细胞或肿瘤细胞) 为了获得对促凋亡信号的耐受而依赖的途径之一。相反， 根除肿瘤细胞的药物开发可通过融合多不饱和脂肪酸残基至CL上而刺激线粒体CL氧化。方法之一可通过使用多不饱和脂肪酸残基作为一种无毒的营养方法。

　　5 线粒体心磷脂氧化的调节与细胞凋亡的控制

　　CL氧化是凋亡早期事件， cyt c/CL复合体形成也许可成为控制凋亡的重要靶点。CL可利用性是cyt c活化为CL加氧酶的重要阶段， 对CL在线粒体中迁移的调节可作为靶点。凋亡线粒体中tBid可刺激CL重新分布， 因此tBid与线粒体相互作用也可作为靶点［11］。控制有利于cyt c/CL过氧化酶活性形成的氧化还原环境是另一个影响凋亡CL氧化的方法之一。cyt c/CL过氧化酶中间物的高氧化性电位易被内源性底物或外源性物质还原［12］。抗坏血酸， 半胱氨酸， GSH和其它低分子量的硫氢基， 维生素E同系物是一种类型， 而酚类和含SH药物代表另一种类型。然而该设想没有考虑重要的结构因素， 它也许可影响大分子还原物质与只能与小分子作用的cyt c催化位点靠近。研究发现丙泊酚可抑制CL的氧化， 小分子NO， 它可作为cyt c/CL过氧化物酶复合物活性中间物的还原剂。因此， NO和可释放 NO的化合物也许可通过cyt c/CL复合体而调节CL氧化［13］。此外， 可推测线粒体NOS参与了cyt c/CL复合体过氧化物酶活性的调节， 从而阻止CL氧化。

　　由于cyt c/CL复合体过氧化物酶需要h3O2或有机 (脂质) 过氧化物， 除去这些氧化性物质同样可抑制CL加氧酶活性。GSH依赖机制(GSH过氧化物酶)［14］， 硫氧还蛋白以及过氧化氢还原剂［15］也许可通过各自的酶通路有效移除过氧化物。凋亡时阻断电子传递可影响超氧游离基形成［16］。超氧游离基自发或通过MnSOD的催化岐化可产生h3O2， 从而促进cyt c/CL复合体过氧化酶反应。因此， 阻止超氧化物产物也许是抑制CL氧化的潜在机制。氧化亚氮基团也许是理想的清除线粒体超氧化物的物质。它可控制超氧游离基和h3O2。首先， 它们易被电子传递还原产生羟胺， 从而阻止氧还原为超氧游离基。羟胺基可作为自由基清除剂而产生氧化亚氮， 从而进行循环。第二， 氧化亚氮基团可发挥其类似SOD活性并岐化超氧游离基［17］。第三， 氧化亚氮的过氧化氢酶活性可直接清除h3O2。然而这些特性需要线粒体中有较高浓度的氧化亚氮。这一直影响了氧化亚氮抗凋亡方法的利用性。最近的研究表明氧化亚氮显著的抗凋亡活性可通过不同的方法将它们有效导入线粒体而获得［18， 19］。

　　线粒体凋亡过程与CL氧化产物有关， 能抑制CL过氧化反应的脂质抗氧化剂也许可作为抗凋亡因子。鬼臼乙叉甙， 一个凋亡诱导剂， 同时是一个有效的脂质基团清除剂和脂质抗氧化剂。凋亡时CL氧化由紧密结合的cyt c/CL复合体过氧(化)物酶催化， 这可抑制鬼臼乙叉甙与该过程产生的中间物作用。然而鬼臼乙叉甙可作为过氧化物酶底物而竞争抑制cyt c催化的CL氧化反应， 这种抑制浓度远比其诱导凋亡的浓度高。因此cyt c/CL过氧化物酶复合体催化的CL氧化不能被这种药物促凋亡浓度所抑制。

　　6 结语

　　线粒体凋亡时膜间隙主要蛋白之一cyt c可与主要膜磷脂CL相互作用， 形成的复合体不能作为呼吸链电子穿梭体， 但可作为CL特异的加氧酶。CL氧化也许是凋亡一个必须的机制， 当CL氧化如同缺乏CL酵母细胞一样变得不可能或无效时， 旁路途径也许起作用。cyt c/CL复合体过氧化物酶激活对于凋亡是必须的。氧化CL可促进促凋亡因子由线粒体释放至胞质。cyt c这种特性依赖其氧化还原属性。cyt c氧化还原属性以及其与不同CL分子相互作用的特性对于CL氧化及其参与细胞(包括肿瘤细胞)对凋亡敏感性的调节是重要的。这种凋亡早期的发现也为药物开发提供了新的靶点。

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