γ射线与LPS作用于小鼠巨噬细胞RAW264.7的生物学效应

　　　　作者：饶亚岚， 丛 悦， 陈肖华*， 董波， 李峰生， 张军权， 高玲， 毛秉智

【摘要】 目的: 研究γ射线与LPS协同激活小鼠巨噬细胞RAW264.7的效应机制， 以及γ射线与LPS诱导钙结合蛋白S100A8的表达及意义。方法: 相差显微镜观察细胞形态; 流式细胞计数方法检测细胞周期及活性氧介质（ROI）水平; Griess颜色反应测定细胞NO水平; 实时定量RTPCR方法检测细胞S100A8 mRNA水平的表达。结果: γ射线与LPS作用于RAW264.7细胞引起细胞形态改变， 部分细胞出现非整倍性， 少量细胞出现凋亡， 胞内ROI水平、 NO水平明显升高， S100A8 分子mRNA水平明显升高， 而且这些效应几乎都比γ射线或LPS单因素的作用要强。结论: γ射线与LPS协同诱导巨噬细胞激活是细胞周期改变、 信使分子水平变化、 炎症因子如S100A8的表达等多方面生物效应的综合结果， 其中S100A8基因的表达与巨噬细胞功能状态密切相关。

【关键词】 巨噬细胞; γ射线; LPS; S100A8

　　巨噬细胞在整个免疫反应中起极为重要的作用， 辐射后许多组织和器官损伤都涉及到巨噬细胞的功能异常， 巨噬细胞的辐射效应一直受到重视。巨噬细胞通常具有辐射抗性， 但已有多篇报道证明电离辐射能够促进或直接激活巨噬细胞。一氧化氮（nitric oxide， NO）的生成是巨噬细胞被激活的重要标志， 单纯的射线不能引起小鼠巨噬细胞J774.1和RAW264.7细胞中NO水平的改变， 但0.5～10 Gy 射线预处理能够触发这些巨噬细胞为干扰素γ（interferonγ， IFNγ）和（或）脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）诱导生成NO， 而且呈现剂量效应关系［1］。

　　钙结合蛋白S100A8是S100蛋白家族成员， 是一个多功能分子， 其最主要的功能是参与免疫炎症反应过程［2］。Stassen等［3］研究发现， 6 Gy X射线照射MCF7细胞后48～72 h， S100A8被诱导表达， 其 mRNA水平呈现辐射剂量效应关系。静息态的巨噬细胞不表达S100A8， 激活状态的巨噬细胞才表达S100A8分子， S100A8在巨噬细胞中为LPS等炎症因子诱导表达［4］。既然S100A8能够为电离辐射及LPS诱导表达， 那么我们需要进一步研究在巨噬细胞中， 电离辐射是否与LPS协同诱导S100A8以及S100A8的表达与巨噬细胞功能状态之间的关系。本研究观察比较了RAW264.7细胞受10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理24 h与正常对照、 相应单纯γ射线或单纯LPS处理组细胞形态、 周期、 活性氧介质（reactive oxygen intermediates， ROI）水平、 NO水平及S100A8 mRNA等指标的改变并探讨相互之间的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 试剂LPS、 2’7’二氯荧光素双醋酸盐(2， 7dichlorofluorescin dictate， DCFHDA)、 碘化丙啶(propidium iodide， PI)为美国Sigma公司产品。RPMI1640培养基干粉、 胎牛血清、 TRIzol试剂为美国Invitrogen公司产品。随机引物、 MMLV逆转录酶为美国Promega公司产品。BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit为杭州博日公司产品。FACS Calibur 流式细胞仪为美国BD公司产品。Linegene荧光定量PCR检测系统为杭州博日公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 RAW264.7细胞培养及处理 小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液， 37℃、 50 mL/L CO2饱和度条件下培养。对数增殖期细胞照射前24 h， 换新鲜培养基， 不辐射或10 Gy 60Co γ射线照射， 照射后24 h， 不加或加入5 mg/L LPS， 继续培养24 h。相差显微镜观察细胞形态变化。

　　1.2.2 流式细胞术测定细胞周期 乙醇固定骨髓单细胞悬液， PI染色， 流式细胞仪检测， 具体按文献［5］进行。

　　1.2.3 流式细胞术测定ROI水平 约1×106 RAW264.7细胞铺种于6孔板中， 培养过夜， γ射线或(和)LPS处理后不同时间收集细胞， 用无血清RPMI1640培养液洗2遍细胞后， 20 μmol/L DCFHDA悬浮细胞， 37℃孵育30 min， 无血清RPMI1640培养液洗涤1遍后， 0.5 mL无血清RPMI1640培养液悬浮细胞， 流式细胞仪检测。

　　1.2.4 NO水平检测 通过Griess颜色反应测定细胞培养上清中NO-2水平， NO-2水平以吸光值A550表示， 具体方法参照文献［1］进行。

　　1.2.5 实时定量RTPCR检测S100A8表达 用 TRIzol试剂提取RAW264.7细胞总RNA， 经紫外分光仪检测A260和A280， 测定浓度和纯度。取总RNA 2 μg， 随机引物0.5 μg， M MLV逆转录酶200 U， 进行25 μL体系反转录。每PCR反应取2 μL反转录产物为模版， 加入BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit试剂， 于荧光定量PCR检测系统进行实时定量PCR扩增测定CT（Treshhold cycle）值。小鼠S100A8上游引物5′ATCACCATGCCCTCTACAAGA3′， 下游引物5′TGCTACTCCTTGTGGCTGTCT3′。看家基因3磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase， GAPDH）上游引物5′CCATGGAGAAGGCCGGGG3′， 下游引物5′CAAAGTTGTCATGGATGACC3′。用比较CT方法， 以看家基因GAPDH为内参， 以未处理正常细胞中S100A8 mRNA水平为1， 相对定量γ射线或(和)LPS处理后S100A8 mRNA的表达水平。相对表达倍数=2^(-△△CT)， 其中△△CT=γ射线或(和)LPS处理样品的△CT -正常对照的△CT， △CT=S100A8的CT-GAPDH的CT 。

　　1.2.6 统计学分析 所有数据均以x±s表示， 应用SAS9.13统计软件进行两因素析因设计资料的方差分析。

2 结果

　　2.1 RAW264.7细胞形态学改变 观察比较RAW264.7细胞受10 Gy γ射线照射后24 h， 5mg/L LPS继续处理24 h与正常对照、 相应单纯γ射线或单纯LPS处理组细胞形态学变化， 可见正常RAW264.7细胞为圆形， 贴壁生长; 单纯γ射线或单纯 LPS处理的细胞变大， 部分细胞伸出伪足、 呈梭形， 胞内颗粒增多， 两种处理细胞形态学改变类似; γ射线与 LPS共同作用的细胞变得更大， 胞内大量颗粒物， 巨噬细胞呈现被激活状态。

　　2.2 RAW264.7细胞倍性、 凋亡的改变 正常未处理的RAW264.7细胞中非整倍性（aneuploid）细胞、 凋亡细胞百分数均为0%; 10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理24 h及相应单纯γ射线或单纯LPS处理条件下， 细胞均出现部分非整倍性细胞; 而只在γ射线与LPS共同作用条件下， 细胞才出现明显凋亡（图1）。

　　2.3 RAW264.7细胞胞内ROI水平的改变 观察10 Gy γ射线照射后0～24 h胞内ROI水平的动态变化， 照后即刻开始升高， 6 h达高峰， 24 h基本恢复到正常水平（图2）， 可见胞内ROI早期生成明显， 随后下降， 因此我们比较细胞受各种处理后6 h， 胞内ROI水平的改变。单纯10 Gy γ射线照射后30 h（即10 Gy γ射线照射后24 h， 0 mg/L LPS继续处理6 h）， 胞内ROI水平不变; 单纯5 mg/L LPS处理后6 h（即0 Gy γ射线照射后24 h， 5mg/L LPS继续处理6 h）， 胞内ROI水平升高; 10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理6 h， 胞内ROI水平明显升高， 从测定数值看， 明显高于单纯5 mg/L LPS处理后6 h或单纯10 Gy γ射线照射后胞内ROI的水平（图3， 图2）。图2 10 Gy γ射线照射后0～24 h胞内ROI水平的变化

　　2.4 RAW264.7细胞NO水平的变化 单纯γ射线照射， 胞内NO水平不变; 单纯LPS处理条件下， 与正常对照相比， 胞内NO水平升高; 10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理24 h， 胞内NO水平明显升高， 而且高于单纯LPS处理组， 表明γ 射线能够促进LPS增强巨噬细胞RAW264.7中NO水平（图4）。

　　2.5 RAW264.7细胞中S100A8 分子mRNA表达水平的改变 实时定量RTPCR方法检测胞内S100A8 mRNA水平的变化。以未处理正常细胞中S100A8 mRNA水平为1， 单纯10 Gy γ射线处理条件下， 胞内S100A8 mRNA水平为9.0±2.3; 单纯5 mg/L LPS处理条件下， 胞内S100A8 mRNA水平为86.0±8.3; 10 Gy γ射线与5 mg/L LPS共同作用条件下， 胞内S100A8 mRNA水平为630.0±70.8。可见， γ射线、 LPS均可诱导巨噬细胞RAW264.7中S100A8 mRNA表达， LPS的作用强于γ射线， 而且γ 射线与LPS具有协同作用。

　　3 讨论

　　我们的研究表明， RAW264.7细胞受10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理24 h条件下， γ射线与LPS共同作用影响细胞多方面的生物学效应， 具体表现为细胞体积明显变大， 胞内大量颗粒物， 呈现被激活状态; 部分细胞呈现非整倍性， 少量细胞出现凋亡; 胞内ROI水平、 NO水平明显升高; S100A8 分子mRNA水平明显升高， 而且这些效应几乎都比γ射线或LPS单因素的作用要强。

　　γ射线与LPS共同作用使RAW264.7细胞形态改变， 胞内大量颗粒物的出现可能反应了细胞酶活性的改变。我们检测了RAW264.7细胞受0～40 Gy γ射线照射后0～72 h细胞倍性、 周期、 凋亡的改变， 发现随时间、 剂量不同， 细胞周期呈动态改变， 但细胞几乎不出现凋亡， 只在γ射线与LPS共同作用条件下细胞才出现凋亡， 一定程度说明细胞具有辐射抗性; 部分细胞呈现非整倍性， 而且这部分细胞DNA含量为正常未处理细胞的两倍， 非整倍性的出现可能与细胞分裂受到抑制、 细胞功能的改变或细胞分化状态相关。

　　ROI和DNA损伤是辐射信号转导中的主要信使分子。我们观察到0～40 Gy射线照射后6 h， RAW264.7细胞胞内ROI水平随照射剂量增加呈现增强趋势， LPS能引起胞内ROI水平升高， 而且 射线的预处理大大增强了LPS引起细胞ROI水平升高的效应。已有的研究表明， 0～10 Gy γ射线照射后24 h， RAW264.7细胞的DNA损伤随受照剂量增加而增强［6］。在 射线促进IFNγ引起J774.1细胞中NO生成的过程中， 第二信使是DNA损伤而非ROI［1］。

　　S100A8能够为辐射诱导表达， 紫外线诱导小鼠表皮角化细胞中S100A8的表达， ROI参与了此过程［7］。此外， 大鼠肝部受20 Gy射线照射后6 h S100A8蛋白水平升高， 而且该分子的诱导表达可能与受辐射后肝部ROI水平升高有关［8］。我们的研究发现， 单纯γ射线或单纯LPS处理条件下， RAW264.7细胞中S100A8 mRNA水平升高， 而且γ 射线与LPS具有协同作用。我们还检测了通常与S100A8形成复合物行使生物学功能的S100A9分子mRNA的表达， 未能检测到各种处理条件下该分子的表达及变化， 这与已有报道的研究结果一致［3， 4， 7， 8］， 说明S100A8本身具有功能特异性。我们的预实验表明， ROI及转录因子激活蛋白1(activator protein1， AP1)可能参与了辐射诱导RAW264.7细胞中S100A8表达的过程。S100A8与炎症反应密切相关， 那么S100A8诱导表达可能与RAW264.7细胞活性增强有关。此外， S100A8/A9复合物及S100A8、 S100A9具有抑制细胞增殖、 诱导细胞凋亡的功能［9］， γ 射线与LPS能够增强RAW264.7细胞中S100A8表达、 引起该细胞凋亡， 两者之间是否存在某种关联还需要进一步的实验验证。

参考文献

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