不同剂量脂多糖预处理对哮喘小鼠肺部炎症的影响的研究

　　　　　　作者：李鸿佳， 王淑娟， 李艳丽， 董亮

【摘要】 目的: 研究不同剂量脂多糖（LPS）通过诱导肺泡巨噬细胞（AM）Toll样受体4（TLR4）的高表达， 探讨其对哮喘小鼠肺部炎症的影响。方法: BALB/c小鼠随机分为哮喘模型组（OVA）A， 低剂量LPS处理组（0.1 mg/L LPS+OVA）B， 高剂量LPS处理组（100 mg/L LPS+OVA）C， 对照组（生理盐水）D。用卵白蛋白（OVA）致敏与激发建立小鼠哮喘模型; 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）上清中IL4、 IL5、 IL13和IFNγ的含量， 实时荧光定量PCR法测定AM的TLR4的表达， 光镜观察肺组织病理变化。结果: 与A组相比较， B组BALF上清中IL4、 IL5和IL13的水平显著增高（P&<0.05）， 而IFNγ差异无统计学意义（P&>0.05）， C组BALF上清中IL4、 IL5和IL13的水平显著降低， IFNγ显著增高（P&<0.05）; 与A组相比， B组与C组AM的TLR4mRNA表达均明显增高（P&<0.05）， 两组间差异无统计学意义; 光镜下， A组支气管黏膜下水肿， 黏液腺增生， 可见大量以嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润。B组与C组上述情况未见减轻， 并出现肺泡腔及间质充血， 中性粒细胞等大量的炎症细胞浸润， D组管腔内无黏液栓， 气道周围无炎症细胞浸润， 肺泡壁结构完整。结论: 低剂量LPS(0.1 mg/L)诱导哮喘小鼠AM的TLR4高表达， 使肺部炎症加重， 而高剂量LPS(100 mg/L)可能会减轻变态反应症状。

【关键词】 肺泡巨噬细胞; 脂多糖; Toll样受体4; 支气管哮喘

　　支气管哮喘(简称哮喘)是一种以嗜酸性粒细胞为主的众多炎症细胞和炎症因子参与的慢性气道炎症性疾病［1］， 其发病率呈逐年上升趋势， 室内灰尘， 革兰阴性杆菌的内毒素等在哮喘气道炎症中的作用存在很大的争议。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌的一类重要的病原体微生物成分， 研究发现， LPS浓度可影响Th1/Th3炎症反应。高水平LPS可使具有抗原特异性的Th1反应增强， 低剂量LPS可使Th3敏感性增高， 提示LPS可能在过敏性炎症反应中具有独特的双向作用［2］。TLR4是LPS的主要模式识别受体， TLR4结合LPS等病原体相关分子模式后通过释放细胞因子可促进Th1细胞分化， 从而可能在哮喘免疫和宿主保护中起重要作用， 但目前尚没有足够证据证明TLR4能直接识别Th3型免疫应答。我们试图运用不同剂量LPS干预小鼠哮喘模型， 研究LPS诱导AM表面TLR4激活机制， 探讨TLR4激活在哮喘发病机制中的信号转导途径， 进一步明确其在哮喘小鼠气道炎症加重的机制中的作用。

1 材料和方法

　　1.1 材料 鸡卵蛋白（OVA， GradeＶ， 纯度＞98%， Sigma）， 超纯脂多糖(ultrapure LPS， E．coli O111: B4， Sigma)， BALB/c小鼠(6～8周龄， 雌性)由山东大学试验动物中心提供， 小鼠IFNγ和IL4 ELISA试剂盒购自深圳晶美生物公司， 小鼠IL5和 IL13 ELISA试剂盒购自上海西唐生物公司， 总RNA抽提与纯化试剂盒购自Roche公司， SYBR Green Ι购自Roche公司， SpectorΙ型酶标分析仪（美国）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组与模型建立 将40只雌性BALB/c小鼠随机分为4组， 每组10只， A组为哮喘组， B组为低剂量LPS处理组（0.1 mg/L LPS+OVA）， C组为高剂量LPS处理组（100 mg/L LPS+OVA）， D组为生理盐水对照组。A组于第1(实验开始当天)、 8 d分别腹腔内注射OVA混悬液每次50 μg， ［OVA/AL(OH)3为10 mg/g］， 第15天将小鼠置于自制的有机玻璃盒中， 给予雾化吸入OVA(10 g/L OVA/PBS)， 每天30 min， 连续1周。D组致敏与激发均以生理盐水代替OVA。B组和C组分别在致敏阶段每隔2 d腹腔注射1 mL含0.1、 100 μg E．coli LPS， 激发阶段在每次激发前1 h腹腔注射相同剂量浓度E．coli LPS。各组小鼠在末次激发24 h以后处死。

　　1.2.2 BALF标本的收集 对小鼠行气管插管， 在左主支气管处结扎左肺， 用3 mL冰磷酸盐缓冲盐水(PBS)分3次灌洗右肺， 回收液体量&>80%为合格， 约2.5 mL/鼠， 1 000 r/min， 离心10 min， 4℃ 离心， 收取各组细胞上清液， -80℃保存待测。

　　1.2.3 AM的分离与培养 BALF离心后沉淀用生理盐水3 mL重悬、 再离心， 反复洗涤3次， 然后用RPMI1640培养液（含2 mmol/L谷胺酰氨， 100 mL/L胎牛血清， 100 U/L青霉素， 100 U/L链霉素）4 mL混悬细胞， 于孵箱中37℃、 50 mL/L CO2孵育2 h后， 轻轻吸出上清， 去除非贴壁细胞。用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液重悬， 调整细胞浓度为108/L， 培养24 h， 以Giemsa染色法鉴定AM， 台盼蓝染色检测其活性。

　　1.2.4 AM总RNA提取及逆转录 按TRIzol一步法RNA提取试剂盒说明书提取RNA。抽提出的RNA经紫外分光光度计测定总RNA浓度， A260/A280为1.9。逆转录条件为42℃ 1 h， 70℃ 10 min， 逆转录为cDNA。

　　1.2.5 实时荧光定量PCR（Realtime fluorescence quantitative PCR）检测基因表达 目的基因TLR4， F 5′CAGAACTTCAGTGGCTGGA3′， R 5′ATTTTGTCTCCACAGCCACC3′（180 bp）; 内参照βactin， F 5′CCTTCCGTGTTCCTACCCC3′， R 5′GCCCAAGATGCCCTTCAGT3′（131 bp）。实时定量PCR样品反应体系采用SYBR Green Ι， 其最终的反应体系为20 μL， 循环条件为: 92℃ 120 s， 92℃ 5 s， 60℃ 60 s， 40℃ 5 s进行45个循环， 所有循环结束后， 绘制溶解曲线判断扩增产物的特异性。每个样品均设置相应未经逆转录的模板作为阴性对照， 绘制βactin、 TLR4的荧光曲线和溶解曲线， 并得到各自的荧光域值循环数(Ct值)， 计算其均值的比值。

　　1.2.6 BALF上清中细胞因子的检测 IL4、 IL5、 IL13、 IFNγ的测定采用小鼠ELISA 检测试剂盒， 按试剂盒说明书进行操作， 根据光密度值（A）计算含量。

　　1.2.7 肺组织病理学观察 小鼠处死后， 打开胸腔， 切取未行支气管肺泡灌洗的左肺近肺门组织， 40 g/L多聚甲酸溶液固定24 h， 常规石蜡包埋， 苏木素伊红（HE）染色， 在扩大400倍的显微镜下观察小鼠肺组织和黏膜上皮的炎症浸润情况。

　　1.2.8 统计学分析 检测结果均以x±s表示， 采用SPSS13.0统计软件处理。多组间比较采用单因素方差分析， 两组间比较采用NK检验， P&<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

　　小鼠哮喘模型造模成功， 出现明显的烦躁不安， 呼吸急促， 腹肌抽搐， 大、 小便失禁， 毛发竖起， 部分小鼠出现反应迟钝， 动作迟缓; 而生理盐水对照组小鼠无明显异常表现。

　　2.1 小鼠肺组织病理学改变 高倍显微镜下观察可见， A组支气管黏膜下水肿， 黏液腺增生， 黏膜皱褶增多， 黏膜及黏膜下层、 平滑肌外均可见大量以嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润， B组与C组上述情况未见减轻， 并出现肺泡腔及间质充血， 中性粒细胞等大量的炎症细胞浸润， D组气道上皮无增厚， 气道周围无炎症细胞浸润， 肺泡壁结构完整（图1）。

　　图1 肺组织病理切片（HE染色， ×400）

　　2.2 小鼠BALF细胞因子水平的检测 A组肺泡灌洗液上清中IL4、 IL5、 IL13和IFNγ的水平显著高于D组（P&<0.05）; 与A组相比， C组IL4、 IL5和IL13水平显著降低， IFNγ水平显著升高（P&< 0.05）， B组IL4、 IL5和IL13水平显著增高（P&<0.05）， 而IFNγ差异无统计学意义（表1）。表1 BALF中IFNγ、 IL4、 IL5和IL13含量

　　2.3 小鼠AM中TLR4mRNA的表达情况 与A组相比， B组与C组TLR4mRNA表达能力显著增强（P&<0.05）， 而D组与A组TLR4mRNA表达能力差异无统计学意义（表2）。表2 AM中TLR4mRNA的荧光域值循环数

3 讨论

　　哮喘的主要特征是慢性气道炎症和气道高反应性， 其发病及演变主要受控于Th3型细胞分泌的细胞因子［1］。室内灰尘， 革兰阴性杆菌的内毒素等在哮喘气道炎症中的作用存在很大的争议， LPS是革兰氏阴性细菌的一类重要的病原体微生物成分， 近年来TLRs的发现为机体对LPS的免疫应答提供了新的线索［2］。

　　AM是一类重要的抗原提呈细胞， 其表面的TLR4作为LPS的主要跨膜受体， 介导了肺部的炎症反应， 首先形成的LPS/LBP/CD14复合物， 在MD2的辅助下， 通过接头蛋白MyD88（myeloid differentiation protein， 髓样分化蛋白）， 使IRAK(IL1 receptor associated kinase， IL1受体相关激酶)、 TRAF（TNFα receptor associated factor， 肿瘤坏死因子受体相关因子）6、 MAPKKK(MAPK kinase kinase)家族依次活化， 从而激活NIK（NFκB诱导激酶）、 IKK（IκB激酶）， 使NFκB解除抑制入核转录［3， 4］; TRAF6还可通过激活MAPKKK、 MAPKK、 ERK、 P38和JNK/SAPK通路， 最后导致转录因子AP1家族的成员jun和fos活化［5］， 进而诱导各种炎症因子如TNFα、 IL1、 IL6等大量释放， 加重了肺部炎症。

　　我们通过建立不同浓度LPS预处理的哮喘小鼠模型， 发现两组LPS预处理的小鼠， AM的TLR4mRNA表达与哮喘模型组相比均明显增强， 而不同剂量LPS处理的哮喘小鼠之间， AM的TLR4mRNA表达差异并无统计学意义， 提示我们AM的TLR4是LPS引起免疫应答的主要受体， LPS可诱导哮喘小鼠AM的TLR4mRNA的表达上调， 而OVA并不能刺激TLR4mRNA表达增强， 这与Eswarappa等［7］的研究相一致。

　　同时发现LPS暴露水平可以决定机体产生炎症反应的类型［6］， 暴露于含高浓度LPS（100 mg/L）的OVA的小鼠， 其气道的变态反应症状减轻， 主要以中性粒细胞浸润为主， 粘液分泌不明显， Th1型细胞因子IFNγ明显增加， 主要与肺损伤有关; 而暴露于含低浓度LPS（0.1 mg/L）的OVA的小鼠， 其哮喘症状加重， 肺部以嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润为主， 粘液分泌增加， 抗原特异性Th3型细胞因子IL4、 IL5和IL13明显增加［8］， 这使得卫生学假说对于内毒素的暴露使Th平衡向着减弱Th3型的方向发展的理论， 在哮喘的发病机制中还需进一步深入研究， 我们推测这可能与重症哮喘以及哮喘的急性发作密切相关， 这有待于我们试验的进一步探讨与证实。

参考文献

［1］ Goetzl EJ. Changing paradigms in the immunological science of allergy: 2008［J］. Curr Allergy Asthma Rep， 2008， 8(1): 28-31.

［2］ Hollingsworth JW， Whitehead GS， Lin KL， et al. TLR4 signaling attenuates ongoing allergic inflammation［J］. Immunol， 2006， 176(10): 5856-5862.

［3］ Noulin N， Quesniaux VF， SchnyderCandrian S， et al. Both hemopoietic and resident cells are required for MyD88dependent pulmonary inflammatory response to inhaled endotoxin［J］. Immunol， 2005， 175(10): 6861-6869.

［4］ Chen F， Du Y， Zhang Z， et al. Syntenin negatively regulates TRAF6mediated IL1R/TLR4 signaling［J］. Cell Signal， 2008， 20(4): 666-674.

［5］ Koch A， Knobloch J， Dammhayn C， et al. Effect of bacterial endotoxin LPS on expression of INFgamma and IL5 in Tlymphocytes from asthmatics［J］. Clin Immunol， 2007， 125(2): 194-204.

［6］ Celedón JC， Milton DK， Ramsey CD， et al. Exposure to dust mite allergen and endotoxin in early life and asthma and atopy in childhood［J］. Allergy Clin Immunol， 2007， 120(1): 144-149.

［7］ Eswarappa SM， Basu N， Joy O， et al. Folimycin (concanamycin A) inhibits LPSinduced nitric oxide production and reduces surface localization of TLR4 in murine macrophages［J］. Innate Immun， 2008， 14(1): 13-24.

［8］ Jung YW， Schoeb TR， Weaver CT， et al. Antigen and lipopolysaccharide play synergistic roles in the effector phase of airway inflammation in mice［J］. Am Pathol， 2006， 168(5): 1425-1434.