【摘要】 目的: 研究不同剂量不同时间铁、 铝、 铅元素神经细胞生存能力的影响和Vit C在铁、 铝、 铅元素诱导神经细胞凋亡中的作用。为探讨微量元素生理功能提供理论依据和资料。方法: 采用体外培养脑胶质瘤细胞， MTT比色法测定40 μmol/L、 400 μmol/L浓度下的三氯化铝、 硫酸亚铁、 醋酸铅3种药物及3种药物联合250 μmol/L Vit C对脑胶质瘤细胞体外生长的影响。结果: 24 h醋酸铅、 三氯化铝联合维生素C实验组， 细胞生长抑制作用明显大于400 μmol/L和40 μmol/L 浓度组。最弱为40 μmol/L浓度硫酸亚铁， 细胞数量明显高于联合Vit C和400 μmol/L浓度组。72 h各实验组对细胞生长抑制作用减弱， 40 μmol/L浓度的硫酸亚铁细胞生长数量明显高于其他实验组。除硫酸亚铁+Vit C、 40 μmol/L 浓度组与对照组无统计学意义， 其他各实验组细胞数量明显低于对照组。结论: 铝离子、 高浓度铅离子和高浓度铁对肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用， Vit C能增强铁、 铝、 铅离子诱导胶质细胞凋亡。其中Vit C对铝离子的效应大于铅离子和铁离子。
【关键词】 铁; 铝; 铅; 胶质瘤细胞; 维生素C; MTT
维生素C（Vitmin C， Vit C）是一种水溶性物质， 具有可逆的氧化还原作用。Vit C是自然界广泛存在的一种抗氧化剂， Vit C联合其他抗癌药物治疗恶性肿瘤方法具有潜能， 体外及动物实验证实它对多种肿瘤有明显的抑制作用。但高浓度Vit C可致细胞毒性， 适量Vit C对体外中脑神经的生长发育有一定的促生长分化作用。研究发现Vit C通过影响细胞周期增强三氧化二砷诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡[1]和诱导肝癌细胞凋亡[2]。铁是细胞生长增殖及机能活动所必需微量元素之一， 在细胞生长周期中铁的调控起重要的作用， Vit C联合Fe2+对细胞生长状态的影响存在一定的剂量反应关系， 不同剂量作用可引起细胞生长状态的不同变化， 适量Vit C/Fe2+可诱导细胞凋亡[3]。铝、 铅元素属于低毒性金属元素， 铝元素可导致神经行为损害、 记忆力减退、 早老性痴呆等某些中枢神经功能障碍。铝可对原代培养皮层神经细胞产生细胞毒性， 可引起细胞结构改变， 抑制皮层神经细胞生长， 并可诱导细胞凋亡[4]。铅元素对心血管系统、 神经系统、 泌尿系统、 生殖系统都有毒性效应， 铅对神经系统有很强毒性高浓度的铅可导致儿童严重的智力低下和不可逆的大脑损伤， 铅接触引起海马神经元细胞凋亡可能是铅损害学习记忆的重要机制之一[5]。研究铁、 铝、 铅元素细胞毒性及Vit C对铁、 铝、 铅元素诱导肿瘤细胞凋亡作用的影响， 为临床提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料 RPMI1640培养液、 胎牛血清购自Gibco公司; Vit C纯品（配制浓度250 μmol/L的Vit C）、 胰蛋白酶购自Sigma公司; 脑胶质瘤细胞株为宁夏医学科学研究所提供; 三氯化铝、 醋酸铅、 硫酸亚铁、 二甲亚砜为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 脑胶质瘤细胞在含有100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中， 置于37℃、 50 mL/L CO2培养箱常规培养。用2.5 g/L胰酶（PBS配）消化传代， 传代密度一般为5×108/L， 传至3代后细胞用于实验， 实验选用对数生长期的细胞， 用2.5 g/L胰酶和0.2 g/L EDTA混合消化液消化， 用培养液稀释成单细胞悬液， 以4000个/孔接种于96孔板中， 待细胞贴壁后吸出原液， 设立对照组与实验组， 每组均设4个平行孔。
1.2.2 MTT比色法测定及其联合Vit C对脑胶质瘤细胞增殖的影响 细胞准备方法同1.2.1， 按以下分组加药， 单独用药6个实验组: 40 μmol/L和400 μmol/L浓度三氯化铝、 硫酸亚铁、 醋酸铅3种药物。联合Vit C3个实验组: 250 μmol/L Vit C分别加40 μmol/L浓度三氯化铝、 硫酸亚铁、 醛酸铅3种药物。1组空白对照组: 每孔加含血清的培养液。移入恒温箱内继续培养， 分别于24、 72 h时间段在倒置显微镜下摄像。每孔加入20 μL MTT（质量浓度为5 g/L， 用0.01 mol/L的PBS配制）在同样条件下培养4 h， 弃去孔内液体， 每孔加入150 μL DMSO， 振荡10 min， 酶标仪测定A490值， 分别计算24、 72 h9组药物对细胞抑制率。抑制率=（空白对照组A490值－实验对照组A490值）/空白对照组A490值×100%。
1.2.3 统计学分析 计量资料x±s描述， 多组平均数的比较用单因素方差分析， 检验水准以P&<0.05为差异有统计学意义， 采用SPSS11.0软件包进行统计。2 结果
药物作用下细胞数量的变化: （1）同一浓度不同药物的实验组比较: 联合组、 单一药物组有相同的变化规律， 72 h变化规律与24 h相同， 24 h细胞数量明显为硫酸亚铁+Vit C&>醋酸铅+Vit C&>三氯化铝+Vit C。40 μmol/L浓度3种药物作用下细胞数量明显为硫酸亚铁&>醋酸铅&>三氯化铝， 统计学分析有统计学意义（P&<0.05）。72 h40 μmol/L浓度细胞数量明显为硫酸亚铁高于40 μmol/L浓度醋酸铅、 三氯化铝， 统计学分析有统计学意义（P&<0.05）。（2）同一时间不同的浓度实验组比较: 24 h检测细胞数量明显为醋酸铅+Vit C、 三氯化铝+Vit C实验组细胞数量明显低于400 μmol/L浓度和40 μmol/L浓度组， 24、 72 h检测硫酸亚铁实验组细胞数量明显为40 μmol/L浓度高于硫酸亚铁+Vit C和400 μmol/L浓度统计学分析有统计学意义（P&<0.05）。（3）同一药物同一浓度不同时间实验组比较: 三氯化铝、 醋酸铅联合Vit C组和40 μmol/L浓度组、 72 h检测细胞数量明显高于24 h， 统计学分析有统计学意义(P&<0.05)。（4）24 h检测三氯化铝、 醋酸铅联合维生素组及40 μmol/L浓度组、 400 μmol/L浓度各实验组细胞数量明显低于对照组(P&<0.05)。测定三氯化铝、 醋酸铅、 硫酸亚铁3种单一药物浓度分别为40 μmol/L、 400 μmol/L实验组及联合Vit C实验组A490值， 计算24、 72 h9组药物对胶质瘤细胞体外生长抑制率。24 h三氯化铝、 醋酸铅+Vit C实验组细胞抑制率最大， 72 h时各实验组细胞抑制率明显小于24 h， 细胞抑制率最小为40 μmol/L浓度硫酸亚铁组（表1）。表1 单一3种药物联合Vit C对胶质瘤细胞体外生长抑制率
3 讨论
MTT（又叫噻唑蓝）是一种四唑盐显色剂， 它能被活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶还原成难溶的蓝黑色结晶并沉积在细胞中， 而死亡细胞则无上述反应。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中紫色结晶， 用酶联免疫检测仪在波长为490 nm处， 测定其吸光值， 可间接反映活细胞的数量及活力[5]。由此还可以推算细胞抑制率， 判断药效的强弱。Vit C近年来常作为辅助药被研究到与其他抗癌药物的协同作用， 如在低浓度Vit C/Fe2+作用可刺激细胞增殖， 并随Vit C剂量增加而凋亡细胞增强[3]。本实验结果Vit C能增强铁、 铝、 铅元素诱导胶质瘤细胞凋亡， 其中Vit C对铝离子的作用大于铅离子和铁离子， 三氯化铝和醋酸铅联合Vit C实验组细胞数量明显低于40 μmol/L浓度、 400 μmol/L实验组和40 μmol/L硫酸亚铁实验组。铁是机体必需元素之一， 去除铁可通过活化细胞内部基因来启动凋亡程序; 另一方面， 铁参与机体活性氧介质的生成， 可通过氧化应激的途径诱导细胞凋亡， 高浓度的铁离子对细胞产生毒性作用， 研究发现脑脊液中高浓度铁离子能促进神经元细胞的凋亡[6]。本实验400 μmol/L浓度硫酸亚铁组与对照组相比表现为明显的抑制作用。实验资料表明， 铅处理后各剂量组大脑皮层、 海马和小脑细胞凋亡率均明显高于对照组， 提示铅接触与细胞凋亡率之间有密切关系。细胞凋亡率与染铅量之间具有良好的剂量-反应关系， 说明铅接触浓度越高， 则细胞凋亡率越高。这与我们此次实验72 h高浓度醋酸铅细胞生长抑制率高于其他实验组结果一致。AlCl3对皮层神经元生长有明显的抑制作用， 与对照组相比具有明显时间剂量反应关系（P&<0.05); AlCl3可使神经细胞核明显固缩、 凝集或断裂， 发生典型的凋亡改变， 随着染毒时间延长和Al3+浓度增加， 凋亡发生率也明显增加[4]， 本实验24 hAlCl340 μmol/L、 400 μmol/L浓度组细胞数量明显低于对照组， 统计学分析有统计学意义（P&<0.05)， 72 h细胞数量与对照组统计学分析无统计学意义。
参考文献
[1] 曹 娟， 郑 洁， 吕秀宁， 等. 维生素C增强As2O3诱导宫颈癌细胞凋亡的研究[J]. 东南大学学报（医学版）， 2005， 25(5): 294-295.
[2] 李 媛， 李晶晶， 胡本容， 等. 三氯化二砷和Vit C联合诱导肝癌细胞凋亡的作用研究[J]. 医药导报， 2006， 25(1): 1-4.
[3] 杨瑞华， 李瑞珍， 海春旭， 等. Vit C/Fe2+对细胞生长状态的影响[J]. 第四军医大学学报， 1999， 20（9）: S54-55.
[4] 李百祥， 任 锐， 扬德文. 铝可对原代培养皮层神经细胞的细胞毒性[J]. 中华劳动职业病杂志， 2006， 24(3): 180-181.
[5] 李 丹， 张 进， 雷荣辉， 等. 铅对大鼠海马神经细胞凋亡及Bcl2、 Bax基因表达的影响[J]. 西安医科学版， 2004， 25（5）: 434-436.
[6] 窦 岩， 刘姚英， 吴建良. 脑室中注入高浓度铁离子诱发大鼠神经元细胞的凋亡[J]. 山西医科大学学报， 2005， 36(6): 665-666.