锌指蛋白265在大鼠睾丸Sertoli细胞中的特异性表达

　　 作者：席晔斌， 李荣平， 王保国， 葛瑜， 沈天伟， 蒋黎华， 李伟毅

【摘要】 目的: 研究锌指蛋白265(ZNF265）在大鼠睾丸Sertoli细胞中的特异性表达。方法: 分离培养SD大鼠睾丸Sertoli细胞， 以免疫荧光染色、 流式细胞术（FCM）检测ZNF265在Sertoli细胞的表达， 且抽提Sertoli细胞总RNA， 用PTPCR法检测ZNF265的表达。结果: 经免疫荧光染色， 实验组Sertoli细胞核核周呈现明亮特异荧光， 对照组未见特异性荧光; FCM检测结果显示实验组Sertoli细胞ZNF265的表达较对照组明显增高; RTPCR扩增出目的条带ZNF265。结论: 大鼠睾丸Sertoli细胞特异性表达ZNF265， 且多表达于Sertoli细胞核核周胞质。

【关键词】 ZNF265; Sertoli细胞; SD大鼠; ZNF265表达

　　锌指蛋白265（Zinc finger protein265， ZNF265）由Karginova等［1］首先于大鼠肾球旁细胞中克隆。研究发现， ZNF265在生物体中有广泛的表达， 尤其在人类和小鼠生殖系统的表达具有特异性。目前研究认为ZNF265具有RNA结合能力［2］， 是一个参与细胞分化、 发育、 基因表达调控的多功能蛋白， 与个体发育， 疾病密切相关。Sertoli细胞（支持细胞）是睾丸主要的基质细胞， 参与血睾屏障的组成和分泌细胞因子。我们以往的研究发现， Sertoli细胞在局部抗感染中发挥着重要的免疫调节作用， 并参与、 维持大鼠睾丸的免疫豁免［3， 4］。本研究旨在探讨ZNF265在大鼠睾丸Sertoli细胞中的表达， 为进一步探讨ZNF265的表达与Sertoli细胞的免疫功能的关系奠定基础。

1 材料和方法

　　1.1 材料 SD大鼠（雄性， 15天龄， 35 g）， 购自上海交通大学医学院动科部。胶原酶II型、 透明质酸酶均购自Worthington公司。小牛血清购自杭州四季青公司。DMEM/F12培养液购自Sigma公司。Triton X100购自 Qbiogene公司。兔抗大鼠ZNF265抗体由复旦大学生命科学院生理学及生物物理系徐平教授惠赠。FITC标记的山羊抗兔IgG抗体购自KPL公司。奥林巴斯IX70倒置荧光显微镜购自Olympus公司。固定/穿透工作液购自eBioscience公司。流式细胞仪（FACSCalibur）购自BD公司。TRIzol购自Invitrogen公司。Superscript II（K1622）试剂盒、 2×PCR Master Mix试剂盒（K0171）均购自Fermentas公司。

　　1.2.1 Sertoli细胞的分离培养 SD大鼠断颈处死， 无菌状态分离取得睾丸组织， 经胶原酶II型、 透明质酸酶消化、 过滤、 离心获得高纯度、 高活率的Sertoli细胞［5］。在含100 mL/L小牛血清的DMEM/F12培养液中于37℃、 50 mL/L CO2条件下培养。

　　1.2.2 免疫荧光染色 将分离得到的Sertoli细胞接种于6孔培养板中（培养板内预置圆形玻片）培养， 待玻片细胞贴壁率为80％时， 用预温pH7.4的0.01 mol/L PBS洗涤， 甲醇固定10 min（甲醇于-18℃预冷）， PBS洗涤， 用0.02 mL/L Triton X100透化破膜2～5 min， PBS洗涤， 然后加入0.5 mL/L正常山羊血清， 室温封闭20 min， PBS洗涤， 加入兔抗大鼠ZNF265抗体100 μL， 置于湿盒内4℃过夜。次日PBS洗涤后， 加入50 μL FITC标记的山羊抗兔IgG抗体， 室温避光30 min， PBS洗涤3次， 双蒸水洗涤3次， 最后950 mL/L甘油封片， 于倒置荧光显微镜下镜检。

　　1.2.3 流式细胞术（FCM）分析 分离得到的Sertoli细胞按5×109/L密度接种于培养瓶内， 次日弃去培养瓶中的液体， 用胰酶消化贴壁细胞， 按5×105/管， 加入流式管中。然后用冷PBS（含1 000 mg/L BSA）洗涤， 1 800 r/min， 离心10 min， 尔后加入1 mL 固定/穿透工作液， 4℃作用1 h， 同上洗涤， 再加入20 μL兔抗大鼠ZNF265抗体37℃孵育1 h， 同上洗涤。然后加入20 μL FITC标记的山羊抗兔IgG抗体， 室温避光15～20 min， PBS洗涤3次， 最后加入500 μL PBS， 流式细胞仪测定。

　　1.2.4 Sertoli细胞总RNA抽提 按TRIzol试剂盒中的说明操作。

　　1.2.5 逆转录反应 按Superscript II试剂盒中的说明操作。

　　1.2.6 PCR反应 引物的设计: （1）ZNF265引物: 按大鼠ZNF265 DNA全长序列， 取自GenBank， 序列号GI: 13928843。5′端引物: 5′caaggtcttcatcacgctca3′， 3′端引物: 5′cacgggatctggaatgttct3′。目的基因产物的长度126 bp。（2）βactin: 按大鼠βactin DNA全长序列， 取自GenBank， 序列号GI: 55574。5′端引物: 5′aggcatcctgaccctgaagtac3′， 3′端引物: 5′tct tcatgaggtagtctgtcag3′。目的基因产物的长度389 bp。以上引物均由申能博彩公司合成。按2×PCR Master Mix试剂盒说明操作， 扩增cDNA所需引物量βactin、 ZNF265标本1均为50 pmol/L， ZNF265标本2为25 pmol/L， 扩增条件如下: 94℃ 1 min， 65℃ 2 min， 72℃ 1 min， 共36个循环， 72℃延伸10 min。扩增后， 将每一标本的βactin和ZNF265 PCR扩增产物加样于同一块15 g/L琼脂糖凝胶电泳。电泳完成后， 将凝胶置于UVP凝胶扫描仪中， 用GrabIT软件拍照得到清晰电泳结果， 存盘。

2 结果

　　2.1 免疫荧光染色检测ZNF265的表达 本实验分为2组， 对照组（未加入ZNF265抗体）和实验组。实验组Sertoli细胞经免疫荧光染色后， 荧光显微镜下观察核周胞质呈现特异明亮荧光， 而对照组未见特异性荧光（图1）。

　　2.2 FCM检测ZNF265的表达 实验分为3组: 空白组（不加入ZNF265抗体和荧光抗体）、 对照组（不加入ZNF265抗体）和实验组。经FCM检测， 实验组Sertoli细胞ZNF265的表达率明显高于对照组（图2）。

　　2.3 ZNF265 mRNA的表达 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图显示在第2、 3条泳道的126 bp处出现了清晰、 明亮的目的条带（图3）。图中第2条泳道PCR时加入的ZNF265 cDNA量为第3泳道的1倍。

　　3 讨论

　　锌指蛋白在1985年首次发现于非洲爪蟾的转录因子IIIA中， 为真核生物转录因子中的重要结构域。睾丸是生殖系统中重要的器官， 也是一个免疫豁免部位（immune privilege site）［6］。Sertoli细胞既是睾丸重要的基质细胞， 也是构成血－睾屏障的重要细胞， 睾酮及细胞因子可通过改变Sertoli细胞上某些蛋白的内吞及再循环而调控血－睾屏障的动力学改变， 而且Sertoli细胞具有吞噬凋亡的精原细胞及降解残体的功能［7］; 同时， Sertoli细胞也是维持、 调控睾丸局部免疫豁免的重要细胞。研究发现， Sertoli细胞是通过分泌TGFβ、 表达FasL， 介导免疫抑制和免疫杀伤机制来维持和调控局部的免疫豁免［6］。

　　研究发现ZNF265蛋白在人的胎儿和小鼠的所有组织中几乎都有表达［8］。但ZNF265在生殖系统不同部位又呈现特异性表达; 如在精子中， ZNF265表达在尾部前端; 在睾丸和附睾中， 则主要分布在血睾屏障、 血附睾屏障; 而在卵巢中， 主要表达在透明带和闭锁卵泡中。ZNF265存在2个组成结构相似的亚型: ZNF2651和ZNF2652， 2个亚型通过反馈方式自我调控转录表达模式［8］。

　　现对ZNF265的研究在人体和小鼠多见， 而未见在大鼠的研究报道。而对ZNF265功能的研究主要集中在基因调控， 其与免疫系统或生殖的关系少有报道。小鼠Sertoli细胞锌指蛋白基因（SERZ）被证实能够调控Sertoli细胞的分化［9］。我们首次通过免疫学方法检测了ZNF265在大鼠睾丸Sertoli细胞中的表达， 证实了ZNF265蛋白特异性表达在Sertoli细胞核核周胞质。为进一步研究ZNF265在睾丸局部抗感染免疫中的作用、 在生殖活动中的作用及ZNF265对Sertoli细胞中有关细胞因子基因和FasL等相关分子基因表达的调控研究提供了实验参考。

参考文献

［1］ Karginova EA， Penotz ES， Kazakova IG， et al. Zis: A developmentally regulated gene expressed in juxtaglomerula cells［J］. Am J PhysiolRenal Physiol， 1997， 42(5): 731-738.

［2］ Adams DJ， van der Weyden L， Kovacic A， et al. Chromosome localization and characterization of the mouse and human zinc finger protein 265 gene［J］. Cytogenet Cell Genet， 2000， 88(1-2): 68-73.

［3］ Li WY， Liu ZP， Xi YB， et al. Effect of FasL high expression on immune regulative function of Sertoli cell in transgenic mouse［J］. J Rep Contr， 2005， 15(4): 209-218.

［4］ Li WY， Chen GJ， Xi YB， et al. The immunoregulative mechanism of the Sertoli cell in the infection by expression of FasL and TGFβ mRNA［J］. J Microbiol Immunol， 2002， 4(2): 34-37.

［5］ Chen GJ， Li WY， Xi YB， et al. Effects of ureaplasma urealyticum on fas ligand expression in rat sertoli cell［J］. Reproduction && Contraception， 2000， 11(3): 128-134.

［6］ Houston A， Bennett MW， O’Sullivan GC， et al. Fas ligand mediates immune privilege and not inflammation in human colon cancer， irrespective of TGFbeta expression［J］. Br J Cancer， 2003， 89(7): 1345-1351.

［7］ Xiong W， Chen Y， Wang H， et al. Gas6 and the Tyro 3 receptor tyrosine kinase subfamily regulate the phagocytic function of Sertoli cells［J］. Reproduction， 2008， 135(1): 77-87.

［8］ Li J， Chen XH， Xiao PJ， et al. Expression Pattern and Splicing Function of Mouse ZNF265［J］. Neurochem Res， 2008， 33(3): 483-489.

［9］ Chaudhary J， Skinner MK. Identification of a novel gene product， Sertoli cell gene with a zinc finger domain， that is important for FSH activation of testicular Sertoli cells［J］. Endocrinology， 2002， 143(2): 426-435.