hTSHR胞膜外区片段真核表达载体的构建和表达

【摘要】 目的: 构建人类促甲状腺激素受体（hTSHR）胞膜外区氨基端的两个片段hTSHRf（aa29～100）、 hTSHRe（aa101～278）的真核表达载体pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe， 并在CHO细胞中进行表达。方法: RTPCR法从人甲状腺正常组织的cDNA中扩增hTSHRf和hTSHRe，定向插入真核表达载体pcDNA3.1(D)/V5HisTOPO中， 经酶切、 PCR和测序鉴定后通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行表达， RTPCR扩增转染细胞的cDNA、 Western blot分别鉴定hTSHR在CHO细胞中mRNA和蛋白水平的表达。结果: RTPCR分别扩增两个片段的阳性克隆株， 所得片段大小与预期一致， 经Western blot鉴定， 相对分子质量（Mr）分别为11900、 23600左右， 与预期的大小相符。结论: 真核表达载体pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe构建成功， RTPCR和Western blot检测证实重组质粒能在CHO细胞中高效表达， 为进一步研究pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe在体内的基因表达， 建立Graves'病的动物模型奠定了基础。

【关键词】 TSH 受体 真核表达 Graves’病

　　人TSHR是一种跨膜性蛋白， 属于G蛋白偶联受体， 具有7次跨膜结构， 体内主要分布在甲状腺滤泡细胞膜上。hTSHR蛋白由764个氨基酸组成， 相对分子质量（Mr）为84500， 分为膜内区、 跨膜区以及膜外区3个部分［1， 2］， 编码hTSHR膜外区的基因长度是1300 bp， 研究表明TSHR是许多自身免疫性甲状腺疾病（autoimmune thyroid disease， AITD）中主要的自身抗原之一， TSHR膜外区（TSHR extracellular domain， TSHRECD）是其免疫原性区段， 抗TSHR的抗体大多结合于此段。本研究中克隆hTSHRECD氨基端的2个片段编码序列（188～403 bp， 407～904 bp）， 构建其真核表达载体， 并转染CHO细胞，进行稳定表达。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 CHO细胞由中国医学科学院血液病研究所药理室熊东升研究员惠赠，酵母提取物、 胰蛋白胨购自OXOID公司， Ham’s F12、 G418、 OptiMEM无血清培养基购自Gibco公司; FBS和bTSH购自Sigma公司。真核表达载体pcDNA3.1(D)/V5HisTOPO和感受态E.coli TOP10 购自Invitrogen公司。DNA快速纯化回收试剂盒、 限制性内切酶Hind Ⅲ以及Pyrobest DNA聚合酶购自TaKaRa公司; MMLV逆转录酶试剂盒、 化学发光试剂盒购自Promega公司; 质粒回收纯化试剂盒购自博大泰克公司; TRIzol试剂、 脂质体LipofectamineTM2000 Reagent及小鼠AntiHis单克隆抗体（mAb）购自Invitrogen公司; 引物设计合成由上海英俊公司完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PCR引物设计与合成 根据GenBank公布的hTSHR cDNA序列（GenBank: 000369）序列分别设计片段188～403 bp的引物F4: 5′cac catg gag tgc cat cag gag ga g3′， R4: 5′act caa att gta gaa gga gtg tg3′; 片段407 bp～940 bp的引物F5: 5′cac catg gtg act cac ata gaa at3′， R5: 5′tgg gta aga aag gtc agc c3′。上游引物的5′端序列起始密码子ATG前加人Kozak序列（划线部分）以提高转录起始的效率［3］。

　　1.2.2 组织材料获取与总RNA的提取 人正常甲状腺组织30 mg， 加入1 mL TRIzol， 匀浆后加入200 μL氯仿， 摇匀， 室温孵育2～3 min， 4℃， 11000 g离心15 min， 取上清水相至新离心管中; 加400 μL异丙醇， 室温孵育10 min， 4℃， 11000 g离心10 min; 弃上清， 用1 mL750 mL/L乙醇洗涤1次， 4℃， 11000 g离心5 min; 弃上清，空气中干燥10 min， 加RNasefree水溶解， 测RNA浓度， -70℃保存。

　　1.2.3 RTPCR 将人甲状腺正常组织RNA， 逆转录为cDNA， 以hTSHR cDNA为模板， 用Pyrobest DNA聚合酶PCR扩增TSHR片段， 上下游引物分别1 μL（10 mmol/L）， dNTP1 μL（2.5 mmol/L）， 10×buffer2.5 μL， Pyrobest DNA聚合酶0.30 μL（1 U）， 模板2 μL（约150 ng）， ddh3O17.2 μL。反应参数: 95℃预变性2.5 min， 95℃变性45 s， hTSHRf62.7℃、 hTSHRe 54.1℃退火45 s， 72℃延伸45 s， 34个循环; 72℃再延伸5 min。10 g/LTAE琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。

　　1.2.4 载体构建与鉴定 将回收的hTSHRf、 hTSHRe分别与载体1.5∶1混合进行连接， 然后将重组体转化E.coli TOP10， 冰上放置5～30 min， 42℃热休克30 s后， 立即置于冰上， 加250 μL 的S.O.C培基37℃摇床， 1 h; 铺板于Amp+的琼脂糖培养基上， 37℃温箱孵育16 h; 挑取单个菌落于LB液体培养基中， 扩大培养， 小量提取质粒DNA， 以质粒DNA为模板， 分别以F4∶R4和 F5∶R5为引物， Pyrobest DNA聚合酶扩增hTSHR， 反应条件同上; 经Hind Ⅲ酶切后15 g/L琼脂糖凝胶电泳; 测序鉴定由上海英俊生物公司完成。

　　1.2.5 CHO细胞转染与阳性克隆筛选 (1)转染用重组质粒的制备及纯化: 按照提取质粒试剂盒说明大量提取重组质粒，　　并去除内毒素， A260/A280在1.8～2.0之间， -20℃保存， 用于转染。(2)脂质体转染: CHO细胞用Ham’s F12完全培养液（含100 mL/L FBS， 10 mL/L HT， 5 mL/L双抗）常规培养， 传代。转染前先对CHO细胞进行毒性筛选， 以确定其最小致死量， 将细胞铺板于96孔板中， 细胞密度为2×104/孔， G418毒性筛选后确定最小致死量为500 mg/L。转染前1 d， 以2×104/孔CHO细胞接种于96孔板， 每孔加100 μL不含抗生素的Ham’s F12培养基， 使其融合密度为90%， 用25 μL OPTIMEMI培养基分别稀释320 ng DNA和0.8 μL脂质体2000， 后者稀释后室温孵育5 min， 混合稀释的DNA和脂质体， 室温保温20 min; 然后直接将复合物加入到每孔中， 37℃、 50 mL/LCO2孵育4～5 h后更换生长培养基; 次日， 将细胞传代至新鲜培养基中， 48 h后加入500 mg/L G418筛选阳性克隆株， 进行2～3周的稳定表达。

　　1.2.6 目的基因在mRNA水平表达 分别提取转染后和未经转染的CHO细胞的总RNA， 逆转录为cDNA， 以cDNA为模板， F4∶R4和 F5∶R5为引物， PCR分别进行扩增， 反应参数同上。

　　1.2.7 目的基因蛋白水平的表达 用200 μL细胞裂解液裂解稳定表达的CHO细胞制备蛋白样品［4］， 120 g/L的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后， 将凝胶在转移缓冲液中浸泡15 min， PVDF膜剪成凝胶大小在转移缓冲液中浸泡10～15 min， 恒流0.8 mA/cm2， 转膜1～2 h; 50 g/L脱脂奶粉的PBST 4 mL， 4℃封闭过夜， 次日， PBST洗膜， 5 min/次; 由于构建的重组表达蛋白的羧基端有多聚组氨酸6×His的蛋白标签， 一抗用小鼠AntiHis mAb（1∶8000） 4 mL， 37℃孵育2 h; 洗膜（同上）; 加HRP标记的羊抗小鼠 IgG（1∶8000） 2 mL， 37℃孵育1 h; 洗膜（同上）。按照化学发光法说明书， 用发光检测液浸泡PVDF膜后， 在暗室中曝光30 s， 显影1～2 min， 定影5 min， 室温干燥。

　　2 结果

　　2.1 目的基因的获取 提取人正常甲状腺组织RNA， 经RTPCR后， 扩增产物经回收后10 g/L琼脂糖凝胶电泳， 分别可见约220 bp、 540 bp大小片段， 与预期相符。

　　图1 目的基因RTPCR产物琼脂糖凝胶电泳分析（略）

　　Fig 1 Analysis of RTPCR product of hTSHR gene by agarose gel eletropheresis

　　M: DNA marker DL 2000; 1: hTSHRf; 2: hTSHRe.

　　2.2 重组质粒的转化与鉴定 pcDNA3.1D/V5HisTOPO为定向克隆载体， 2个片段均正向插入载体， hTSHR全长Hind Ⅲ的酶切位点有3个: 272 bp、 784 bp和1236 bp， 载体的Hind Ⅲ的酶切位点在T7启动子附近， Hind Ⅲ在T7和272 bp对pcDNA3.1hTSHRf进行酶切， T7启动子与TOPO异构酶的识别位点之间以及188 bp与272 bp之间片段长度约为130 bp; Hind Ⅲ在T7和784 bp对pcDNA3.1hTSHRe酶切， T7启动子与TOPO异构酶的识别位点之间以及407 bp与784 bp之间片段长度约为430 bp， 证实重组质粒的大小及插入方向是正确的（图2）; 测序结果与GenBank中hTSHR的相应片段序列相同。以质粒为模板PCR扩增产物大小分别约为220 bp、 540 bp， 与预期大小相符。

　　图2 重组质粒pcDNA3.1hTSHRf 和pcDNA3.1hTSHRe 经Hind Ⅲ酶切鉴定（略）

　　Fig 2 Restriction endonuclease Hind Ⅲ analysis of the recombinant plamids pcDNA3.1hTSHRf and pcDNA3.1hTSHRe

　　M: DNA marker DL 2000; 1: pcDNA3.1hTSHRf; 2: pcDNA3.1hTSHRe.

　　2.3 转染细胞中hTSHR mRNA表达鉴定RTPCR鉴定阳性克隆细胞， 扩增产物分别约为220 bp、 540 bp， 证明hTSHRf和hTSHRe已经成功整合在CHO细胞基因组中， 并能够转录， 而未经质粒转染的细胞未扩增出任何条带（图3）。

　　图3 RT PCR检测目的基因的表达（略）

　　Fig 3 RTPCR amplifying cDNA of CHO cells transfected by recombinant plamids pcDNA3.1hTSHRf and pcDNA3.1hTSHRe

　　M: DNA marker DL 2000; 1: RTPCR amplifying cDNA of CHO cells nontransfected; 2: pcDNA3.1hTSHRf; 3: pcDNA3.1hTSHRe.

　　2.4 Western blot鉴定TSHR蛋白水平的表达 裂解阳性细胞株， 经SDSPAGE电泳后转印到PVDF膜， 与小鼠AntiHis mAb结合， HRP标记的羊抗小鼠 IgG作为二抗， ECL法显色， 根据标准分子量计算后， 特异条带的Mr约为11900、 23600， 与预期相符（图4）。

　　图4 Western blot检测目的基因的表达（略）

　　Fig 4 Western blot of hTSHRf and hTSHRe

　　3 讨论
　　
　　GD是一种常见的AITD， 其自身抗体TSAb可模拟TSH功能， 兴奋TSHR， 通过多种途径调节甲状腺细胞的生长、 分化， 激素的合成和分泌， 最终导致GD的发生。建立合适的GD动物模型是人们一直以来研究的热点， 目前， 报道的建立GD动物模型的方法包括TSHR真核表达质粒免疫、 表达TSHR的腺病毒免疫［5］、 表达TSHR的成纤维细胞或M12细胞免疫 ［6］、 外源性注入TSHR活化T细胞以及TSAb转基因动物模型等， 最近有报道在体内电穿孔法注射DNATSHR复合物建立GD模型［7］， TSHR核酸免疫被认为是目前建立GD等AITD动物模型的最有希望的一种方法。Kim等［8］证明18.5%的GD患者体内有TSAb和TBAb两种抗体， 但主要是TSAb占优势， 95%以上未经治疗的GD患者血循环中均可检测出TSAb。研究表明， TSHRECD是TSH以及TSHR自身抗体的主要作用部位， 并拥有多个TSH的结合位点、 自身抗体的结合表位以及特异的免疫原肽［9］， 因此， 研究TSHRECD功能对于了解GD发病的分子机制方面尤为重要。研究发现TSAb大多数表位是位于TSHR ECD的氨基端（aa34～37、 40～45及52～56［10］）， Schwarz 等［11］研究证实， 建立GD模型不论是用表达TSHR的腺病毒免疫还是用TSHR的DNA免疫， TSHR的显性表位都位于其氨基端的富含半胱氨酸的残基aa21～41。
　　
　　报道的真核表达载体大多是用hTSHR全长构建的， 在前期的研究中， 我们针对性地用hTSHRECD氨基端的753 bp成功构建了真核表达质粒［12］， 为了进一步研究片段的功能， 我们又将其分成2个片段（aa29～100， aa101～278）， 分别构建了重组质粒pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe， 因该载体具有定向克隆功能， 保证了片段与载体正确定向的连接， 简化了克隆的过程和筛选的步骤， 并能使重组蛋白在CHO细胞中高效表达。结果显示， RTPCR扩增阳性克隆细胞株， 证实了hTSHR在mRNA水平的表达; Western blot证明hTSHR在蛋白水平有表达， 为进一步研究pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe在体内的基因表达， 建立GD动物模型奠定了实验基础。

参考文献

　　［1］ Rocchi R. Clinical utility of autoantibodies directed against TSHR［J］. MLO Med Lab Obs， 2005， 37(4): 10-11， 14-15.

　　［2］ Davies TF， Ando T， Lin RY， et al. Thyrotropin receptorassociated diseases: from adenomata to Graves’ disease［J］. J Clin Invest， 2005， 115(8): 1972-1983.

　　［3］ 马海蓉， 孙 怡， 雷卫祺， 等. HBPI与EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在MCF7细胞中的表达和定位［J］. 细胞与分子免疫杂志， 2007， 23(9): 876-879.

　　［4］ 奥斯伯 FM， 金斯顿 RE， 塞德曼 JG(马学军， 等译). 精编分子生物学实验指南［M］. 4版， 北京: 科学出版社， 2005: 157-169.

　　［5］ McLachlan SM， Nagayama Y， Rapoport B. Insight into Graves’ hyperthyroidism from animal models［J］. Endocr Rev， 2005， 26(6): 800-832.

　　［6］ Nagayama Y. Animal models of Graves’ hyperthyroidism［J］. Endocr J， 2005， 52(4): 385-394.

　　［7］ Kaneda T， Honda A， Hakozaki A， et al. An improved Graves’ disease model established by using in vivo electroporation exhibited longterm immunity to hyperthyroidism in BALB/c mice［J］. Endocrinology， 2007， 148(5): 2335-2344.

　　［8］ Kim WB， Chung HK， Park YJ， et al. The prevalence and clinical significance of blocking thyrotropin receptor antibodies in untreated hyperthyroid Graves’ disease［J］. Thyroid， 2000， 10(7): 579-586.

　　［9］ Pichurin P， Yan XM， Farilla L， et al. Naked TSH receptor DNA vaccination: A TH1 T cell response in which interferonγ production， rather than antibody， dominates the immune response in mice［J］. Endocrinology， 2001， 142(8): 3530-3536.

　　［10］ Tahara K， Ishikawa N， Yamamoto K， et al. Epitopes for thyroid stimulating and blocking autoantibodies on the extracellular domain of the human thyrotropin receptor［J］. Thyroid， 1997， 7(6): 867-77.

　　［11］ SchwarzLauer L， Pichurin PN， Chen CR， et al. The cysteinerich amino terminus of the thyrotropin receptor is the immunodominant linear antibody epitope in mice immunized using naked deoxyribonucleic acid or adenovirus vectors［J］. Endocrinology， 2003， 144(5): 1718-1725.

　　［12］ 朱云娟， 姚 智， 赵紫琴， 等. PcDNA3.1/hTSHRa重组体的构建［J］. 天津医科大学学报， 2006， 12(4): 489-491.