海洛因暴露对小鼠前额叶皮层、 海马和伏核caspase 3表达的影响

　　　　 作者：王莹， 杜克莘， 李 明， 施京红， 谢雯

【摘要】 目的: 观察海洛因暴露对小鼠前额叶皮层（PFC）、 海马（HP）和伏核（Acb）脑组织caspase 3表达的影响， 探讨发育期海洛因暴露是否干扰了学习记忆和成瘾脑区的细胞凋亡。方法: 于胚胎鼠E8～E18 d时， 给孕鼠皮下注射海洛因10 mg/(kg·d)， 建立子宫内海洛因暴露的小鼠模型。按出生前处理将小鼠分为盐水(Sal) 组和海洛因(Her) 组， 待其14 d脑凋亡高峰期时取PFC、 HP和Acb脑区组织， 采用RTPCR和Western blot法检测caspase 3表达变化。结果: 与Sal组相比， Her组小鼠的caspase 3 mRNA在PFC、 HP和Acb脑区的表达明显增加(P&<0.05); 激活的caspase 3蛋白表达也明显增加(P&<0.05)。结论: 海洛因暴露可增加小鼠PFC、 HP和Acb脑区caspase 3的表达， 提示海洛因可通过诱导相关脑区细胞凋亡增多而发挥其神经毒性作用。

【关键词】 海洛因; caspase 3; 前额叶皮层; 海马; 伏核

　　根据中国国家禁毒委报告， 近年来女性毒品滥用者增多， 约占全部吸毒者20%～30%， 其平均年龄集中在育龄期范围(22～27岁)［1］。文献报道， 海洛因暴露不但影响女性的神经、 精神和免疫系统， 还能影响到子代发育， 如新生儿宫内窘迫、 发育迟缓以及子代成年后长期的学习记忆行为缺陷和社会行为障碍［2］。海洛因可迅速通过胎盘屏障和胚胎血脑屏障， 直接作用于发育中的神经细胞， 导致子代成年后神经行为的损伤， 但其细胞及分子机制尚未完全阐明。细胞凋亡是脑发育过程中非常重要的生理机制， 中枢神经系统约有至少50%～80%的神经元细胞发生凋亡， 胚胎期及生后发育期多次出现的凋亡高峰与清除过多的细胞及神经联系有关， 从而使细胞数量得以调整， 建立起精确的神经回路［3］。发育中的中枢神经系统， 如海马、 皮层等脑区， 极易受到药物和毒性制剂的影响， 从而导致细胞凋亡功能紊乱［4］。研究发现， 线粒体凋亡通路可被多种毒性制剂或致畸因子所激活［5］， 宫内海洛因暴露是否影响了动物的学习记忆和成瘾相关脑区的细胞凋亡， 目前尚未见报道。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 标准品海洛因（heroin， 批号171206200614）， 学名二乙酰吗啡， 纯度 98.5%， 由中国药品生物制品检定所（国家麻醉品实验室）提供。TRIzol 购自美国 Invitrogen公司; 反转录PCR试剂盒购自日本 TaKaRa公司， 各种限制性内切酶、 连接酶购自宝生物公司。兔抗鼠 caspase 3 单克隆抗体(mAb)购自美国 Santa Crutz Biotechnology公司; 山羊抗βactin多克隆抗体购自武汉博士得公司; 二抗购自博奥森公司; BCA 蛋白定量试剂盒和ECL增强化学发光剂购自德国 Pierce公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物建模及分组 BALB/c小鼠（2月龄， 体质量20～30 g）60只， 由第四军医大学实验动物中心提供， 雌雄各半， 自由饮食饮水， 昼夜12 h交替光照， 室温 25℃， 湿度 60%左右。每日19: 00 雌雄合笼， 次日晨查精栓或阴道涂片， 以精栓或阴道涂片查到精子做为受精标志， 记为 E0 d。体质量相近的实验动物随机分为盐水组和海洛因组。从 E0～E7各组动物自由进食， E8～E18 d， 盐水组每日1次(21: 00)， 大腿外侧皮下注射生理盐水 20 mL/(kg·d)， 海洛因组则给予海洛因10 mg/(kg·d) 注射， 药物溶于生理盐水中， 浓度为 0.5 g/L。子代分组同亲代孕鼠。

　　1.2.2 RTPCR 检测 子代鼠30 d时， 0.16 mol/L戊巴比妥钠腹腔麻醉， 速断头、 开颅、 分离各脑区， 即刻入液氮， 冻存管分装， -80℃贮存。TRIzol 法提取组织细胞的总 RNA。各取1 μg RNA， 逆转录合成 cDNA。应用 PCR法进行扩增， 检测 caspase 3 基因表达情况（94℃预变性 2 min， 然后以 94℃ 45 s、 60℃ 45 s、 72℃ 1 min， 循环32次， 72℃延伸9 min）， 以 βactin为内参。caspase 3引物序列为上游: 5′GGAGCTGGACTGTGGCATTGA3′; 下游: 5′CAGTTCTTTCGTGAGCATGGA3′， 产物长度322 bp; βactin引物序列为上游: 5′ATCATGTTTGAGACCTTCAACAC3′; 下游: 5′ TCTGCGCAAGTTAGGTTTTGTC3′， 产物长度825 bp）。琼脂糖凝胶电泳后扫描DNA条带的光密度值， 将各组阳性条带与相应的 βactin的比值作为其 mRNA的相对表达量。

　　1.2.3 Western blot 检测 子代鼠脑组织取材同于RTPCR实验。蛋白抽提试剂盒提取线粒体， 胞浆蛋白后， BCA法进行蛋白质定量。两组各取 50 μg蛋白， 加入6×上样缓冲液， 煮沸5 min， 进行SDSPAGE， 电泳完毕， 湿转至硝酸纤维素滤膜， 50 g/L 脱脂奶粉室温封闭 2 h后， 加入 caspase 3（1∶1 000）mAb， 4℃过夜， TBST 洗涤3 次， 每次10 min， 加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3 000)， 室温孵育1 h， TBST 洗涤4 次， 每次15 min， ECL 显影。以βactin 为内参照。采用GDS8000型凝胶成像分析系统测量各阳性条带的光密度， 将各组阳性条带与相应的βactin条带光密度比值作为其蛋白的相对表达量进行半定量分析。

　　1.2.4 统计学分析 组织细胞的mRNA表达率和蛋白表达率均用%表示。所有数据以x±s表示， 组间比较采用单因素方差分析（One WayANOVA）， 结果以P&<0.05为有统计学意义， 使用SPSS13.0软件进行数据处理。

　　2 结果

　　2.1 海洛因暴露对caspase 3 mRNA表达的影响 RTPCR检测， 半定量分析得到各组caspase 3 mRNA表达的相对光密度值， Her组caspase 3的转录活性显示与Sal组的相对比值。与Sal组相比， Her组动物的PFC， HP和Acb三个脑区组织的caspase 3 mRNA的表达均明显增加（P&<0.05， 图1）。

　　2.2 海洛因暴露对caspase 3蛋白表达的影响 Western blot检测， 半定量分析得到各组caspase 3蛋白表达的相对光密度值， Her组caspase 3蛋白表达显示为与Sal组的相对比值。与Sal组相比， Her组动物PFC， HP和Acb三个脑区组织激活的caspase 3 (Mr 17 000)蛋白表达均明显增加（P&<0.05， 图2）。

　　3 讨论

　　Jurkat细胞和新鲜分离的T淋巴细胞研究显示， 吗啡促进细胞凋亡［6］。Oliveira等［7］在未分化的PC12细胞上应用吗啡、 海洛因、 可卡因及安非他明时发现， 这些药物均可诱导细胞凋亡的发生， 但阿片类制剂（海洛因和吗啡）诱导细胞凋亡的能力比精神兴奋剂（安非他明和可卡因）更强， 导致凋亡的细胞更多。皮层神经元经海洛因处理后， caspase 3 被激活， 同时线粒体电位和 bcl2/bax 的比例降低［8］。吗啡和海洛因也可以作为外源性 Mu阿片受体（MOR）激动剂发挥作用， 即负性影响海马功能和减少成熟期海马神经元的再生， MOR可能在调节祖细胞存活中发挥作用［11］。尽管细胞学研究取得的证据表明， 吗啡及其衍生物海洛因均能影响神经元功能， 但是， 海洛因如何影响发育中的脑目前仍不清楚， 需要更多的动物实验资料。本研究显示， 发育中晚期海洛因暴露可导致动物的前额叶皮质， 海马和伏核组织激活的 caspase 3表达增加， 提示这些脑区对凋亡信号的敏感性增加， 或细胞凋亡加速产生。凋亡的效应期由 caspases级联反应构成， caspases是涉及蛋白溶解系统活化的一组半胱氨酸蛋白酶家族， 多数与凋亡有关， 其被激活后发生凋亡蛋白酶的层叠级联放大反应而导致细胞消亡。大部分毒性制剂或致畸因子都能通过线粒体凋亡途径发挥作用［5］， 凋亡被诱导后， 细胞色素C释放至胞浆， 与 Apaf1一起激活 caspase9。活化的 caspase9对 procaspase 3进行剪切并导致其活化。活化的 caspase 3可以对其底物进行特异性降解， 从而执行凋亡。caspase 3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶， 被誉为死亡蛋白酶。本研究中 caspase 3的表达增加意味着海洛因可作用于学习记忆和成瘾脑区， 导致其细胞凋亡增多， 这与文献报道的动物成年后的认知功能受损是一致的。

　　海马和皮层脑区在神经发生期间非常敏感， 容易受外界致畸因素的影响， 损伤认知等行为的发育［5］。海洛因对发育期海马的作用非常复杂， Yanai在与本研究相同动物模型上做的系列研究发现， 海洛因作用的靶蛋白是涉及多种类型神经递质受体（谷氨酸受体、 乙酰胆碱受体等）和激素信号传入所共享的信号级联反应蛋白， 对不同的神经递质（乙酰胆碱、 去甲肾上腺素等）做出不同的细胞应答［9， 10］。前额叶皮层和伏核是中脑皮质边缘系统神经回路的重要组成部分， 成瘾记忆形成的关键脑区。Chang等［11］观察到动物通过压杆自身给药时， 位于前额叶皮层和伏核有约30%～35%的神经元活动增强， 提示海洛因通过激活这两个脑区内特异类型的神经元活动， 而影响了海洛因成瘾动物的觅药行为。海马、 前额叶皮层和伏核的细胞凋亡紊乱可直接影响到该脑区神经元和神经回路的精确构建， 进而影响其功能。　　 海洛因暴露对成年动物的神经、 精神、 免疫和脑高级功能系统均证实有毒性作用［12］。本研究结果提示， 发育期海洛因暴露可能通过选择性地干扰了胚胎鼠的细胞凋亡过程， 而导致其特异脑区形态结构异常， 进而出现成年以后长期的神经行为障碍， 要阐明海洛因影响发育脑凋亡通路的机制， 还需进一步研究。

参考文献

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