百草枯人工抗原的合成及抗体的制备

　　　　 作者：杨婷婷， 孙秀兰， 邵景东， 王洪新

【摘要】 目的: 制备百草枯人工抗原和抗血清， 为建立酶联免疫吸附法提供技术储备。方法: 以4， 4’联吡啶和碘甲烷为起始原料， 于暗处通氮气保护下合成了百草枯半抗原; 混合酸酐法偶联大分子蛋白载体牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白（OVA）制备免疫抗原和包被抗原; 免疫新西兰大白兔， 制备多抗。结果: 合成的半抗原经HPLCMS、 1HNMR和IR鉴定， 初步确定合成成功; 百草枯半抗原与BSA和OVA的结合比分别为19∶1和14∶1; 抗血清经间接ELISA法检测， 效价达1∶2.56×104， 经饱和硫酸铵沉淀法纯化后抗体的效价达1∶5.12×104。结论: 合成的百草枯人工抗原具有较好的免疫原性， 为百草枯酶联免疫检测（ELISA）试剂盒的研制提供了基础。

【关键词】 百草枯; 抗原; 抗体; 免疫检测

　　百草枯（paraquat， PQ）又名克无踪、 对草快， 化学名为1， 1’二甲基4， 4’联吡啶阳离子盐， 是一种广谱、 灭生性有机杂环类除草剂［1］。百草枯可经胃肠道、 皮肤和呼吸道吸收， 易导致肺纤维化［2］。为了保护人类健康和环境安全， 许多国家严格限制使用百草枯［3］。我国2005年发布并实施的国家标准食品中最大农药残留限量中规定蔬菜、 柑橘、 小麦粉中百草枯的最大残留限量分别为0.05、 0.2、 0.5 ppm。高效液相色谱分析法、 气相色谱分析法等仪器分析法样本前处理及测定过程繁琐， 费用高， 不适于大量样本筛查。而酶联免疫吸附检测法（Enzymelinked Immunosorbent assay， ELISA）灵敏度高， 特异性强， 仪器设备要求低和样本前处理相对简单等优点， 适于现场监控和大量样本筛查。特异性抗体的制备是建立免疫分析法的必要前提。百草枯的相对分子质量(Mr)仅为257 000， 属于半抗原， 而且自身没有可供偶联的活性官能团（如氨基、 羧基等）。本研究在前期工作中， 选择百草枯结构类似物4， 4’联吡啶， 设计和合成了具有活性羧基的百草枯半抗原。我们采用混合酸酐法合成人工抗原， 并进行结构鉴定， 经免疫新西兰大白兔后， 获得了较高效价的特异性多克隆抗体。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 二噁烷、 无水三正丁胺、 牛血清白蛋白（BSA）、 卵清蛋白（OVA）均购自Sigma公司; 氯甲酸异丁酯购自Fluka公司; 弗氏完全、 不完全佐剂购自北京生物制品研究所; 四甲基联苯胺（TMB）、 羊抗兔IgG购自北京博奥森有限公司; 其他试剂均为分析纯。紫外可见光分光光度计 Spectronic 1.70为意大利GBC公司产品; Nexus 670型傅立叶变换红外光谱仪为Nicolet公司产品; 酶标仪MK3购自上海智理科学仪器有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 混合酸酐法合成百草枯人工抗原 （1）取前期合成的百草枯半抗原（PQh）16 mg溶于600 μL二噁烷中， 搅拌使其溶解。然后加入无水三正丁胺70 μL， 将此混合物在4℃冰浴中冷却， 并搅拌15 min。加入重蒸的氯甲酸异丁酯30 μL， 4℃左右搅拌30 min。（2）52 mg BSA溶于4.5 mL水中， 用0.1 mol/L的NaOH调pH至9.0。将上述PQh溶液逐滴加入到溶解的蛋白中， 并于4℃轻微搅拌4 h， 整个过程维持pH在9.0。然后， 将混合物于4℃对0.1 mol/L pH7.4的PBS中透析72 h， 每隔6 h换透析液1次。冷冻干燥后于-20℃保存。用同样的方法合成包被抗原PQhOVA［5］。

　　1.2.2 百草枯人工抗原结构的鉴定 所得的百草枯人工抗原采用Nexus 670型傅立叶变换红外光谱仪(IR)鉴定结构。

　　1.2.3 人工抗原偶联比的测定 （1）摩尔消光系数ε的测定。配制PQ浓度为0、 0.01、 0.02、 0.03 g/L的水溶液， 通过紫外扫描可知PQ的最大吸收波长为260 nm， 在260 nm处测吸光值， 每个浓度做平行样。摩尔消光系数ε＝吸光值/摩尔浓度。（2）人工抗原中蛋白质含量的测定。采用Bradford法测定人工抗原中蛋白质含量， 以超纯水配制BSA浓度分别为0.01、 0.02、 0.04、 0.06、 0.08、 0.1 g/L， 配制人工抗原浓度为1 g/L， 在波长为595 nm下测定其吸光值， 绘制CA曲线， 并计算人工抗原中蛋白质含量［6］。（3）偶联比的测定。配制0.1 g/L BSA的水溶液， 将偶联产物用超纯水稀释到0.1 g/L， 在260 nm处测吸光值， 以超纯水为空白， 吸光值为A1、 A2。偶联比率r为: r=［（A2－A1）/ε］/（0.1/65 000）， 其中ε为摩尔消光系数（L/mol）， 65 000为BSA分子量， 0.1为BSA浓度（g/L）。

　　1.2.4 抗体的制备 将合成的百草枯人工抗原（PQhBSA）免疫2只健康雄性新西兰大白兔（质量在2.0 kg左右）。免疫前1周从耳缘静脉采血作阴性对照。称取1 mg PQhBSA， 用5 mL 0.1 mol/L的PBS（经高压灭菌）溶解， 然后取0.5 mL溶解的抗原与0.5 mL完全福氏佐剂充分混合， 乳化后在新西兰大白兔背部进行多点皮下注射。1个月后进行第1次加强免疫， 采用四肢内部肌肉注射， 剂量与首次免疫相同， 与等量不完全福氏佐剂混合充分乳化。共免疫5次， 每次间隔2周。每次加强免疫前从兔耳静脉采血， 采用间接ELISA法测定抗血清的效价。效价合格后， 兔颈动脉放血， 分离抗血清， 并采用饱和硫酸铵沉淀法［7］纯化抗体， 制成冻干粉， 于-20℃保存。

　　1.2.5 抗体效价的测定 采用间接ELISA法测定抗体的效价。（1）包被: 将酶标板每孔加入100 μL PQhOVA（用0.05 mol/L pH9.6的Na2CO3NaHCO3缓冲液从1 g/L的储备液倍比稀释）， 4℃， 静置过夜。取出， 用0.1 mol/L、 pH7.4的PBSTween缓冲液（含0.5 mL/L Tween20）满孔洗涤3次， 扣干。（2）封闭: 每孔加250 μL 10 g/L BSAPBS溶液(溶于0.01 mol/L PBS， pH7.4)， 进行封闭， 37℃保温2 h， 弃去封闭液， PBST洗涤3次， 每次1 min， 扣干。（3）加抗血清: 将抗血清用1 g/L BSAPBS溶液倍比稀释。每孔加100 μL不同稀释度抗血清（纯化前和纯化后）和阴性血清（免疫前兔血清）， 做3个平行， 37℃孵育1 h。PBS Tween洗涤， 扣干3次。（4）加酶标二抗: 每孔加100 μL羊抗兔IgGHRP结合物（用1 g/L BSAPBS溶液按体积比1∶5 000稀释）， 37℃孵育0.5 h， 然后用PBST缓冲液洗涤扣干4次。（5）显色反应: 每孔加入配制好的四甲基联苯二胺（TMB）底物液100 μL， 37℃孵育15 min， 取出， 立即加入50 μL 2 mol/L硫酸终止反应。用酶标仪测A450值。（6）效价确定: 以阴性血清的吸光值为标准， 吸光值大于或等于该值的2.1倍所对应的抗血清的稀释度即为该血清效价。

　　2 结果

　　2.1 百草枯半抗原的合成结果 由于百草枯衍生物暴露在空气中易氧化， 实验在Van Emond等［4］的合成方法的基础上加以改进， 使反应在通氮气保护并避光条件下进行， 以4， 4’联吡啶和碘甲烷为起始原料， 严格控制反应物的量， 经三步反应合成了百草枯半抗原N甲基N′戊酸基二吡啶二溴化物（简称PQh）， 从而减缓了产物的氧化。用HPLCMS、 1HNMR、 IR对三步的反应产物结构进行了鉴定， 经分析证明合成的百草枯中间体纯度较高， 三步反应的产物纯度分别为950 mL/L、 700 mL/L和960 mL/L， 得率分别为860 mL/L、 750 mL/L、 690 mL/L， 可不经纯化直接用于与蛋白偶联。

　　2.2 百草枯人工免疫原的紫外吸收图谱 由于百草枯半抗原的紫外吸收在260 nm左右， 而BSA在260 nm和280 nm均有吸收， 将BSA及PQhBSA用凝胶色谱紫外检测器检测， 由图1中的A和B可以看出， BSA在260 nm的吸收比280 nm的弱， 当百草枯半抗原接BSA后， 由C和D可以看出， PQhBSA在260 nm的吸收增强， 可初步确定蛋白与百草枯半抗原偶联成功。

　　2.3 人工免疫原PQhBSA的IR鉴定 通过比较BSA和PQhBSA的红外吸收光谱， 发现在2 800 cm-1～3 400 cm-1区域以及1 500 cm-1～1 700 cm-1区域具有相似的吸收， 此为蛋白质中氨基酸的特征吸收， 说明合成的PQhBSA化合物具有BSA的特征官能团。将PQhBSA与PQh的红外光谱进行比较， 在800 cm-1～1 200 cm-1之间， 出现了明显的百草枯半抗原特征峰， 而BSA在此处无明显吸收， 说明PQhBSA具有PQh的特征官能团（图2）， 由此说明PQhBSA人工免疫原偶联成功， 可以用来免疫实验动物。

　　2.4 百草枯人工抗原偶联比的计算 由PQ、 BSA和PQhBSA的紫外扫描结果， 图3可以看出， PQh在260 nm处具有特征吸收， BSA在278 nm具有特征吸收， PQhBSA与两者相比发生了明显变化， 表明半抗原与载体蛋白成功地发生了偶联。以吸光度（Y）对相应的浓度（X）作标准曲线， 回归方程为Y=6.7375X+0.027， R2=0.9949。参照标准曲线制作步骤， 取待测的人工抗原稀释15倍， 最后测得A595值为0.122， 对照标准曲线方程知， 蛋白浓度为0.014 g/L。由此可知， 样品的实际浓度为0.211 g/L。PQhBSA在260 nm处其吸光值为0.358， 同浓度的BSA的吸光值为0.132。计算得PQ最终的平均摩尔吸光系数为7731.2 L/mol。根据计算公式， 则免疫抗原中PQh与BSA的偶联比为: r=（0.358-0.132）/7731.2/（0.1/65000）=19∶1， 同理计算包被抗原中PQh与OVA结合比为14∶1。

　　图3 PQ、 BSA和PQhBSA的紫外扫描图谱2.5 抗体的效价 根据方阵滴定原理， 采用间接ELISA法测定纯化前后抗百草枯抗体的效价， 结果显示， 当包被原浓度为1.0 mg/L时， 抗血清效价达2.56×104， 抗体纯化后冻干粉的效价则达5.12×104。这说明PQhBSA免疫原的合成是成功的， 而且纯化后抗体的效价有所提高。

　　3 讨论

　　在农药残留的免疫学分析中， 人工抗原的合成是制备抗体和建立免疫分析方法最关键的步骤。半抗原偶联到载体上的数目常会影响到抗体的滴度， 但到目前为止， 最佳的偶联数目尚无定论， 一般认为在8～25之间较合适［8］。本研究将合成的百草枯半抗原采用混合酸酐法偶联到载体蛋白（BSA、 OVA）上， 偶联比分别为19∶1和14∶1。然后免疫兔子获得了高效价的抗百草枯多克隆抗体。当包被原浓度为1.0 mg/L时， 抗血清效价达2.56×104， 抗体纯化后冻干粉的效价则达5.12×104， 这说明纯化对于抗体效价的提高起到了作用。这为下一步百草枯ELISA试剂盒的研制提供了依据。

参考文献

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［3］ 吴厚斌， 宋俊华， 马 进， 等. 百草枯在欧盟批准继续使用［J］. 农药科学与管理， 2004， 25（1）: 36-37.

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［5］ Spinks CA， Wang B， Mills EN， et al. Development of an ELISA for paraquat: improvement of antibody characteristics by reversed affinity chromatography［J］. Analyst， 1999， 124(6): 847-850.

［6］ 陈新建， 陈梅英， 赵会杰. 免疫学技术在植物科学中的应用［M］. 北京: 中国农业大学出版社， 1998: 54-58.

［7］ 王廷华， 李官成， Zhou XinFu. 抗体理论与技术［M］. 北京: 科学出版社， 2005: 315.

［8］ 贺铁明， 胥传来， 王武康. 盐酸克伦特罗免疫原的合成与鉴定［J］. 中国粮油学报， 2004， 19（2）: 85-88.