RAI16蛋白合成肽多克隆抗体的制备及初步应用

　　　　 作者：雒喜忠， 王阁， 许文， 李琼， 陈川， 张志敏， 胡庆， 王东

【摘要】 目的: 制备RAI16蛋白的合成肽多克隆抗体， 并进行初步鉴定和应用， 为研究RAI16蛋白的功能及作用机制获得重要的实验工具。方法: 应用Fmoc法化学合成RAI16蛋白N端第44～55位氨基酸的多肽， 经C18的RPHPLC纯化后， 通过高碘酸钠法将纯化的RAI16蛋白的多肽与KLH交联; 皮下注射抗原免疫新西兰纯种大耳白兔， 加强免疫得到抗血清， 应用蛋白G纯化获得多克隆抗体。对纯化的抗体进行ELISA、 免疫组化、 Western blot等初步鉴定和应用。结果: 化学合成RAI16蛋白N端第44～55位氨基酸的多肽， 纯化后多肽纯度为96％ ， 达到免疫用抗原标准。多肽与KLH交联， 用于免疫动物。经纯化后的抗体效价为1∶125 000。该多肽抗体可特异识别人脾脏组织中相对分子质量(Mr)约为55 000的RAI16蛋白。结论: 所制备的多克隆抗体能与天然RAI16蛋白发生特异性反应， 可应用于ELISA、 免疫组化、 免疫沉淀和Western blot等实验， 为确定RAI16蛋白的组织分布和亚细胞定位、 研究RAI16蛋白的功能及作用机制提供了重要的实验工具。

【关键词】 视黄酸诱导蛋白16; 多肽抗原; 多克隆抗体; ELISA; 亲和层析

　　近几年在对视黄酸（RA）作用研究中发现了视黄酸诱导蛋白（RAI）系列基因， 但尚无具体完整的结构和功能研究的相关报道， 只是推测RAI 系列蛋白可能是一种“新型”的胞内参与信号转导转录调控的蛋白质家族。视黄酸诱导蛋白16（RAI16）蛋白作为家族成员之一， 了解其结构功能， 对认识整个家族特征具有重要的意义。

　　我们前期工作以Tec激酶结构域作为“钓饵”蛋白， 利用酵母双杂交技术筛选构建于转录激活结构域(AD)载体的人胎肝cDNA文库， 经营养缺陷选择及诱导筛选及初步鉴定， 发现并确证了一个新的阳性克隆， 对筛库所得基因片段测序经BLAST比对分析后， 确定为RAI16(Homo sapiens retinoic acid induced 16)基因， 已被GenBank收录(编号为BC052237)， 组织来源为脑Ⅳ型星状细胞瘤， 其编码蛋白为RAI16。并由此推译出其蛋白质一级结构， 对其功能区、 信号肽、 亚细胞定位、 二级结构及亲疏水性等进行了分析。研究表明， RAI16蛋白是一种定位于胞质内内质网上的分泌型的球形信号蛋白， RAI16蛋白很可能在肝干细胞和肝癌诱导分化过程中， 作为RA诱导蛋白被信号蛋白分子募集至胞质内， 通过磷酸化、 去磷酸化、 豆蔻酰化、 酰胺化等修饰， 通过不同的活化形式和剪切方式以及胞质与胞核间的移位， 完成其在信号转导中的重要角色［1］。因此推测RAI16蛋白可能为RA信号通路中一类胞质内重要“新”的信号蛋白分子。结合前期工作， 根据人RAI16蛋白的cDNA 编码的氨基酸序列， 结合计算机分子模拟设计11个氨基酸多肽， 经与载体蛋白KLH 偶联作为免疫原， 免疫家兔制备多克隆抗体， 并经亲和层析进行纯化。从而制备出可与天然RAI16蛋白发生特异性结合反应的抗RAI16蛋白的合成肽多克隆抗体， 为进一步深入研究RAI16蛋白的功能、 阐明RAI16在肝癌细胞诱导分化信号转导通路中的作用和明确RAI16与Tec蛋白之间的相互作用机制作奠定了基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 免疫和筛选用的RAI16蛋白cDNA编码的氨基酸序列N端第44～55位氨基酸的多肽为化学合成， 免疫用抗原C端交联载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH)， 均由上海艾比玛特公司采用合成肽自动合成仪合成。Methylated bovine serum albumin(MBS)和福氏佐剂为Sigma公司产品。HiTrapTM Protein G HP抗体纯化柱为Amersham公司产品。羊抗兔IgGHRP和 DAB为北京中杉金桥生物技术公司产品。ECL反应试剂盒为Amersham公司产品。SephadexTMG25 脱盐柱(Amersham Biosciences， Sweden)、 小牛血清、 牛血清白蛋白、 loading buffer为TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司产品; 免疫用兔子系新西兰纯种白兔2只（1.5个月左右， 雄性健壮， 质量为2 000～ 2 200 g）， 由上海申旺实验动物中心提供。

　　1．2 方法

　　1.2.1 RAI16合成肽的设计 结合前期的研究， 从GenBank中检索到RAI16蛋白cDNA全长序列， 利用DNAstar软件根据抗原指数(Antigenic Index)、 亲水性结构(Hydrophilicity Plot)、 柔韧区(Flexible Regions)及表面概率结构(Surface Probability Plot) 4个参数及特异性、 合成难易程度等方面综合分析RAI16序列的特点， 确定氨基酸片段为欲合成的肽序列， 从N端起包含第44～55位氨基酸， 其序列为: CSTPAKKTDIPWRNh3。

　　1.2.2 RAI16蛋白N端多肽抗原的合成及其与KLH 和BSA 的交联 RAI16合成肽由上海艾比玛特公司采用合成肽自动合成仪合成。化学合成采用Fmoc方法， 从C端向N端合成， 获得的多肽经常规C18的RPHPLC柱进行纯化。纯度为96%。RAI16与KLH和BSA的交联采用戊二醛连接法， 将5 mg合成肽加入7 mg KLH和BSA中， 边振荡边缓慢加入新鲜配制的3 g/L 的戊二醛溶液 (1 mL)， 室温作用2 h。以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜， 交联形成RAI16KLH、 RAI16BSA偶联物。

　　1.2.3 RAI16蛋白合成肽抗体的制备 取200 μg合成肽KLH偶联物与等量的完全福氏佐剂充分乳化后， 于兔颈部和背部皮下多点注射， 每点约100 μg。4周后加强免疫， 剂量同前， 用不完全福氏佐剂充分乳化后， 于兔背部皮下多点注射; 以后隔2周加强免疫1次; 从第3次加强免疫开始， 每次免疫后7 d， 经耳中央动脉采血测定抗体的效价， 经过4次加强免疫后符合要求时， 立即颈动脉采血， 分离血清后， 无菌分装保存于-80℃备用。

　　1.2.4 ELISA检测抗血清效价 用人脾脏微粒体蛋白和合成肽BSA偶联物以1 mg/L 的浓度包被ELISA检测板， 每孔100 μL， 4℃孵育过夜后， 用10 mL/L胎牛血清封闭， 37℃ 2 h后， 洗涤备用。取出包被好的检测板， 每孔加入按1∶2梯度稀释的抗血清100 μL (对照为正常兔血清)， 37℃孵育30 min， 洗涤3次后每孔加入1∶5 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG 100 μL， 37℃孵育30 min， 洗涤3次后进行TMB显色， 37℃孵育15 min， 中止反应后， 用酶标仪测定样品的A450的吸光值。

　　1.2.5 抗体血清的亲和纯化 将获得的兔抗人RAI16多肽的抗体血清用结合缓冲液(100 mmol/L Tris/HC1， pH7.5， 100 mmol/L NaC1)稀释后， 经0.45 μm的滤膜过滤， 加样到HiTrapTM ProteinG HP的纯化柱上， 用洗脱缓冲液(100 mmol/L甘氨酸HCL， ph3.5)洗脱后， 收集洗脱峰。

　　1.2.6 间接ELISA检测抗体相对亲和常数 用合成肽交联BSA以1.5 mg/L和1.0 mg/L的浓度包被ELISA检测板， 封闭后加入倍比稀释的已知蛋白浓度的纯化后的抗体， 再加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗， TMB显色测定A450。以抗体浓度的对数为横坐标， A450值为纵坐标作图。以曲线达到水平时的A值为100%， 求出A50即50% A值对应的抗体浓度。按照Kaff=(n-1)/2(n［Ab’］ t - 2 ［Ab ］ t) 算出抗体亲和常数， 其中［Ab’］ t 、 ［Ab ］ t指的是A50时即包被抗原为1.5 mg/L和1.0 mg/L时抗体半饱和时抗体的摩尔浓度， ［Ag］ t、 ［Ag’］ t指的是包被的抗原浓度本实验中即指15 μg和10 μg， n=［Ag］t/［Ag’］t， 本实验中n=2。

　　1.2.7 多克隆抗体的Western blot分析 用RIPA裂解液(10 mL/L NP40， 150 mmol/L NaCl， PBS pH7.2， 2 mmol/L EDTA， 50 mmol/L氟化钠， 0.2 mmol/L矾酸钠， 蛋白酶抑制剂1∶50)裂解冰冻人脾脏组织样品， 冰上孵育30 min后， 13 500 g离心45 min， 获得脾脏组织总蛋白， 取5 g总蛋白裂解液并加入等体积2×SDS加样缓冲液， 于100℃加热5 min后， 进行常规SDSPAGE电泳， 分离胶浓度为100 g/L。电泳结束后， 电转至PVDF膜上， 用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1 h; 然后加入1∶1 000稀释的兔抗人RAI16蛋白N端多肽多抗， 室温下孵育2 h， TBST缓冲液洗膜后， 加入羊抗兔IgGHRP抗体(1∶5 000稀释)， 室温下孵育1 h， TBST缓冲液洗膜后， ECL法显色。

　　1.2.8 RAI16在再生肝组织中表达的Western blot分析 组织蛋白提取按申能博彩RIPA使用说明书操作（同时增加5 mmol/L benzamidine， 1 μmol/L aprotinin A， 1 μmol/L pepstatin， 1 μmol/L leupeptin， 1 mmol/L PMSF， pH7.4）， 上清进行冷冻干燥24 h， 用含蛋白酶抑制剂的PBS 60 μL稀释蛋白沉淀; 对获得肝组织蛋白进行考马斯亮蓝法定量， 调整密度为6 g/L， 样品容积与载样缓冲液等量混合， 实际浓度为3 g/L。样品15 μL/lane， 100℃， 煮沸5 min、 迅速冷却， 短暂离心; 生物素标记Marker ， 10 μL+10 μL载样缓冲液/lane ， 100℃， 煮沸2 min、 迅速冷却， 短暂离心。按生物素标记Marker、 正常对照组、 肝切除术后0.5 h、 1 h、 2 h、 4 h、 8 h、 24 h、 48 h、 72 h的顺序加样后， 进行常规SDSPAGE电泳， 分离胶浓度为110 g/L。电泳结束后， 电转至PVDF膜上， PVDF膜经标记、 PBS洗后入60 g/L nonfat milk的pH7.2的PBS中封闭， 室温1～2 h， 置 4℃冰箱过夜; 然后加入1∶300稀释的兔抗人RAI16多克隆抗体， 同时加入小鼠抗βactin mAb 7.5 μL， 使体积比为1∶2 000， 室温下孵育1 h; PBS缓冲液洗膜后， 加入抗兔HRPIgG、 抗鼠HRPIgG， 工作浓度均为1∶2 500， 抗生物素HRP抗体30 μL， 工作浓度为1∶1 000， 室温孵育1 h， PBS缓冲液洗膜后， ECL法显色， 背景洗涤， 再定影。

　　1.2.9 多克隆抗体的免疫组化染色 取出用丙酮固定的石蜡包埋的大鼠再生脏组织切片， 滴加50 g/L BSA， 室温下封闭20 min， 加入1∶1 000稀释RAI16多肽抗体， 4℃孵育过夜。PBS洗片后加入羊抗兔IgG2HRP， 37℃孵育20 min， PBS洗片后进行DAB显色， 苏木素复染， 返蓝后， 脱水、 透明、 封片， 镜检， 放大400倍拍照记录结果。

　　2 结果

　　2.1 RAI16的氨基酸序列分析 用DNAstar软件根据亲水性结构、 柔韧区、 抗原指数及表面概率结构4个参数对氨基酸序列进行综合分析(图1) 。预测的结果进行综合考虑， 选取欲合成的肽序列为第44～55位氨基酸(图中阴影区)， 其序列为: CSTPAKKTDIPWRNh3。

　　2.2 RAI16蛋白多肽抗原的合成与纯化 化学合成的多肽经HPLC纯化后， 纯度可达96％， 交联KLH后可作为抗原免疫动物。

　　2.3 抗血清的特性鉴定 ①效价测定: 合成多肽经4次动物免疫并进行效价测定确定抗体产生后， 收集兔抗血清， 蛋白G纯化后， 经间接ELISA检测， 效价约为1∶125 000。②相对亲和力常数测定(图2): 用间接ELISA测定纯化后抗体的亲和常数10-5～10-6 M-1。

　　2.4 RAI16合成肽多克隆抗体的Western blot分析 由于RAI16在脾脏组织表达丰度较肝组织显著， 因此选取脾脏组织并将其裂解后获取的总蛋白作为电泳样本， 对纯化的兔抗人RAI16合成肽多克隆抗体进行Western blot分析， 结果发现RAI16合成肽的多克隆抗体可特异性识别脾脏组织中相对分子质量(Mr)约为55 000的蛋白(抗原) (图3)。

　　2.5 RAI16在再生肝组织中表达的Western blot分析 由于在酵母双杂交系统筛选中Tec酪氨酸激酶与RAI16蛋白相互作用的现象， Tec本身与肝癌细胞、 肝干细胞和肝细胞的关系密切， Tec是肝干细胞和肝细胞增殖、 定向诱导分化及凋亡信号转导途径中关键的蛋白激酶连接分子［1］， Tec在肝再生过程中起着重要的调节作用［2］。因此， 将正常肝组织、 0.5 h、 1 h、 2 h、 4 h、 8 h、 24 h、 48 h、 72 h鼠再生肝组织分别裂解后获取的总蛋白作为电泳样本， 用制备的兔抗人RAI16合成肽的多克隆抗体为一抗， 以羊抗兔HRPIgG、 羊抗鼠HRPIgG为二抗， ， 以小鼠抗βactin mAb作阴性对照， Western blot分析RAI16在再生肝组织中的表达。结果发现在从0.5 h到72 h鼠再生肝组织中， RAI16的表达于0.5 h即可检测到， 4 h达高峰（图4）， 提示RAI16直接参与了肝细胞的增殖调控。

　　2.6 RAI16多克隆抗体的免疫组化定位 RAI16蛋白是一种定位于胞质内内质网上的分泌型的球形信号蛋白［1］。经免疫组化实验证明， RAI16多肽多克隆抗体可与大鼠再生肝细胞胞质中的RAI16蛋白结合(图5) 。

　　3 讨论

　　随着人类基因组计划的完成， 蛋白质研究已成为后基因组时代的重要任务。抗体是研究蛋白质的必不可少的工具之一， 在一种新的cDNA被克隆后， 由此推译出的氨基酸序列人工合成多肽并与载体偶联， 免疫制备其抗体， 是一个快速而有效的手段［3］。抗原表位的选择是制备合成肽的关键。一般认为， 亲水性强和具有稳定构象的线性表位， 对于维持抗原的免疫反应性极其重要［4-7］ 。我们通过综合分析RAI16的亲水性， 柔韧性， 抗原性及表面性4个参数预测的结果， 最终确定以亲水性强、 抗原指数高、 表面性及柔韧性好的区域(即44～55位的11个氨基酸)作为RAI16的抗原决定簇。但有些亲水肽段形成的抗原决定簇在变性条件下易受到破坏， 从而影响其抗体的特异性， 因此抗体纯化后需要对其进行全面鉴定［6］。由于RAI16在正常肝组织中表达较低， 而在脾脏、 结肠、 胎盘等组织中有明确的表达， 因此， 我们选择脾脏组织的蛋白作为电泳样本， 对纯化的兔抗人RAI16合成肽的多克隆抗体进行Western blot特异性分析， 结果发现兔抗人RAI16合成肽的多克隆抗体可特异性识别脾脏组织中Mr约为55 000的蛋白(抗原)。　　鉴于RAI16最初作为Tec相互作用蛋白被筛选克隆得到， 提示Tec和RAI16蛋白之间存在相互作用。而Tec是国内外研究较活跃的一个非受体型蛋白酪氨酸激酶， 他主要介导细胞信号转导。已有研究表明Tec 基因是一种与肝再生调控密切相关的早期反应基因［2］， 是肝干细胞和肝细胞增殖、 分化、 凋亡信号转导路径中关键的蛋白激酶连接分子。因此， 我们推测RAI16作为Tec激酶区作用蛋白， 可能与肝再生调控密切相关。我们利用新制备的抗RAI16合成肽多克隆抗体对其在再生肝组织中表达进行Western blot分析， 结果发现在从0.5 h到72 h鼠再生肝组织中， RAI16的表达于0.5 h即可检测到， 4 h达高峰， 提示RAI16具有调控肝细胞增殖的作用。经免疫组化实验证明， RAI16多肽多克隆抗体可与再生肝细胞胞质中的RAI16蛋白结合。此抗体的初步应用， 进一步表明我们所设计和合成的多肽是成功的。制备的高质量的抗RAI16合成多肽抗体效价高、 亲和力强、 特异性好， 能与天然RAI16发生反应， 可进一步用于免疫组化、 免疫沉淀和免疫印迹等实验、 以及其他体外实验分析。该合成肽及其抗体的制备， 为RAI16蛋白功能及作用机制的研究奠定了基础。

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