FicolinA的克隆、 蛋白表达和抗体的制备与鉴定

【摘要】 目的: 克隆小鼠ficolinA（mouse ficolinA）基因， 构建在真核及原核表达载体， 并在大肠杆菌中表达和鉴定其蛋白， 并制备其抗体， 以进一步用于研究小鼠ficolinA的功能。方法: 用RTPCR的方法从新生7 d的C57BL/6小鼠肝脏中运用GeneRacer kit扩增ficolinA cDNA片段， 并将该片段分别插入pVAX1真核表达载体及pGEXKG 原核表达载体中， 实现插入基因的融合， 在IPTG的诱导下在大肠杆菌中表达。用GSTSepharose 4B的柱子对表达的融合蛋白进行纯化， 用SDSPAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。制备ficolinA的多克隆抗体并对其效价进行测定。结果: 成功地构建了pVAX1ficolinA真核表达载体及pGEXKGficolinA原核表达载体， 并在大肠杆菌中获得高效的表达， 表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致。并且成功制备了多克隆抗体。结论: 成功地构建了重组表达载体pVAX1ficolinA及pGEXKGficolinA， 并在E.coli BL21中表达了ficolinA蛋白， 为下一步研究小鼠ficolinA的功能奠定了基础。

【关键词】 小鼠ficolinA; 基因克隆; 蛋白表达; 抗体

　　纤维胶凝蛋白（ficolin）存在于多种动物和人体内， 组织分布广泛。作为一种转化生长因子1结合蛋白（TGFβ）从猪的子宫内膜中分离出来。Ficolin 与甘露聚糖结合凝集素（mannanbinding lectin， MBL）具有类似的结构和功能， 属于补体凝集素的一种。它们是天然免疫中一种重要的“一线防御”分子， 也是继胶原凝素之后的一种重要的糖类模式识别分子［7］。Ficolin的一级结构和空间结构肽链跟MBL和补体蛋白C1q分子相似。研究显示: ficolin很可能像C1q分子和胶凝素那样， 通过其球形的“头部”与病原体的糖类结合位点结合， 而其胶原样区介导调理吞噬［1， 2］。Ficolin介导的调理吞噬可能通过两条途径进行: 一是与病原体结合后激活MASP， 后者裂解补体产生C3b， C4b等调理素， 以促进吞噬细胞内吞作用。二是直接与吞噬细胞表面的ficolin特异性受体结合， 从而拉进了病原体与吞噬细胞之间的距离， 利于病原体被吞噬和清除［7］。鼠ficolinA与猪的ficolin、 人ficolin1、 ficolin2氨基酸序列的同源性分别是60.2、 59.8、 59.8和59.6%。鼠ficolinA在肝脏和脾脏中高表达［5， 6］。我们成功克隆了小鼠ficolinA（mouse ficolinA）基因， 构建在真核及原核表达载体上， 纯化了在大肠杆菌中过度表达ficolinA蛋白， 并制备其抗体， 为进一步研究ficolinA蛋白的功能奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 孕C57BL/6小鼠（SPF 3级 ， 雌性）购自武汉大学动物中心， 真核表达载体pVAX1， 原核表达载体pGEXKG， 大肠杆菌E.coli DH5α和E.coli BL21菌株均由本实验室保存。各种限制性内切酶、 T4 DNA连接酶、 蛋白质质量标准购自MBI公司， 异丙基硫代βD半乳糖甘(IPTG)为Amresco 公司产品， GlutathioneSepharose 4B 亲和层析柱购自Pharmacia公司。兔抗GST抗体由本室制备， 辣根过氧化物酶标记羊抗兔IG购自Promega公司.Generacerkit购于Invitrogen公司。引物的设计与合成: 根据Genebank的ficolinA基因序列(031348)设计引物， 上游引物为: 5′GGATCATATGCAGTGGCCTACGC3′， 含有BamHⅠ酶切位点; 下游引物为: 5′CAAGCTTGAGACTGGGGCACCTTA3′， 含有EcoR I 酶切位点.引物由上海生工合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 目的基因的扩增与纯化 从出生1周以内的C57小鼠肝脏中提取总RNA， 运用GeneRacer试剂盒进行逆转录PCR， 得到小鼠ficolinA cDNA后， 采用上述引物从ficolinA基因起始密码子处开始进行PCR扩增， 并使ficolinA基因与GST基因处于同一阅读编码框架.扩增反应的条件为: 95℃预变性3 min， 以95℃变性50 s， 55℃退火36 s， 72℃延伸1 min， 22个循环后， 再于72℃延伸10 min。PCR产物以10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将目的条带切下， 用DNA回收试剂盒回收并纯化。

　　1.2.2 重组质粒pGEXKGficolinA和pVAX1ficolinA的构建与鉴定 将纯化的PCR产物和载体pGEXKG及pVAX1用EcoR I和BamH I双酶切后， 分别回收酶切产物， 在T4 DNA连接酶作用下定向将ficolinA基因片段与pGEXKG及pVAX1连接， 以连接产物转化入DH5α感受态细菌， 分别在LB(Amp )及LB（Kan+）培养基中筛选培养。挑取阳性克隆， 培养后小量提取质粒， 用EcoR I和BamH I双酶切筛选阳性重组质粒。

　　1.2.3 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及鉴定 (1)重组质粒的诱导表达: 将鉴定成功的原核重组质粒DNA转化感受态细菌E.coli BL21， 在LB (Amp+)培养基中筛选培养。挑取阳性克隆， 用EcoR I和BamH I双酶切鉴定， 将含有重组表达质粒的E.coli BL21在LB (Amp+)培养液中， 于37℃振荡培养过夜。以1%接种于LB(Amp+)培养液中， 于37℃培养至A600 nm约为0.6时， 加入终浓度为1 mmol/L的IPTG， 于30℃继续诱导培养4 h。离心收集菌体， 经超声碎菌后， 提取融合蛋白， 通过GlutathioneSepharose 4B亲和层析柱进行纯化。(2)SDSPAGE分析: 将纯化的融合蛋白进行SDSPAGE (浓缩胶浓度为50 g/L， 分离胶浓度为120 g/L)分析， 经SDSPAGE后， 用考马斯亮蓝R250染色4 h， 甲醇冰醋酸脱色液脱色并观察结果。(3)Western blot分析: 表达产物经过SDSPAGE电泳后， 电转移至PVDF膜上， 用封闭液(含50 g/L脱脂奶粉的TBST)室温震荡封闭2 h， 加入兔抗GST抗体室温反应1 h， 再加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG， 室温反应1 h， 用二氨基联苯氨(DAB)底物液显色后， 观察结果。

　　1.2.4 ficolinA多克隆抗体的制备和鉴定 选取1只健康家兔。将大量纯化的pVAX1ficolinA质粒， 直接注射到家兔的股四头肌， 注射量为200 μg， 每10 d免疫1次， 共免疫3次。第4次免疫用同样剂量的重组蛋白ficolinA与福氏不完全佐剂等量混匀皮下注射。末次加强免疫后的第10天， 抽血， 分离血清。

　　2 结果

　　2.1 ficolinA基因的扩增与鉴定 从出生1周以内的C57BL/6小鼠肝脏中提取总RNA， 运用generacer试剂盒进行逆转录PCR， 得到小鼠ficolinA cDNA后， 采用上述引物从ficolinA基因起始密码子处开始进行PCR扩增， 所获产物在10 g/L琼脂糖凝胶中电泳， 经EB染色， 在紫外灯下观察到1条约1 000 bp的带， 同预期的目的片段的大小相符(图1)。

　　2.2 重组质粒的构建与鉴定 将重组质粒pGEXKGficolinA和pVAX1ficolinA用EcoR I和BamH I进行双酶切， pGEXKG的大小为5.0 kb， pVAX1的大小为3.0 kb， 扩增产物ficolinA基因的大小约为1.0 kb， pGEXKGficolinA经EcoR I和BamH I双酶切后， 分成5.0 kb和1.0 kb两个片段， pVAX1ficolinA经EcoR I和BamH I双酶切后， 分成3.0 kb和1.0 kb两个片段， 同预期值相符， 表明目的基因已正确插入pGEXKG载体和pVAX1载体中(图2， 3)。

　　2.3 GSTficolinA融合蛋白的表达与分析 培养含有重组表达质粒的E.coli BL21， 用IPTG诱导融合蛋白表达， 表达产物纯化后用SDSPAGE分析。ficolinA蛋白Mr为35 000， GST蛋白Mr为29 000， GSTficolinA融合Mr为64 000。结果表明， 在Mr 64 000处有1条明亮条带， 与预期的Mr相符(图4)。

　　2.4 表达蛋白的Western blot分析 纯化的融合蛋白经SDSPAGE电泳后， 电转移至PVDF膜上， 用抗GST抗体检测， 在Mr 64 000处有1条明亮条带， Mr 29 000处为GST蛋白(图5)。GSTficolinA融合蛋白与预期的Mr相同， 说明得到了正确表达。

　　2.5 ELISA检测抗体效价 取末次加强免疫后第10天的血清， 用间接ELISA测定抗体效价， 结果显示， 免疫前的血清未测出抗体， 比对照血清的A值高两倍的抗血清的最高稀释度为抗血清的效价 （或滴度）约为: 1∶48 000 (图6)。

　　3 讨论

　　Ficolin是补体活化途径的重要发现， 在宿主的天然免疫中发挥着重要的作用。但目前对ficolin只有粗浅的了解。对其功能研究的报道还很少， 主要集中在其对于细菌的调理吞噬作用及活化补体方面的功能， 缺乏系统研究。近年来研究表明ficolin作为纤维胶凝蛋白的一种， 作为可溶性的糖类识别蛋白可与乙酰葡萄糖［8］、 LPS［9］以及一些病原微生物(包括细菌和真菌)［10-12］等结合激活补体凝聚素途径， 国内外许多学者已对其在体外的功能进行了研究。

　　Ficolin跟MBL有相似的结构和功能。Ficolin的纤维蛋白原样结构域被认为是发挥结合碳水化合物的区段。研究报道Ficolin可识别N乙酰葡糖胺（GlcNAc）， 乙酰甘露糖胺［8］， N乙酰半乳糖胺， 弹力蛋白， 皮质激素， 脂膜酸和乙酰基等［6］。ficolin识别某些微生物表面的糖类结构， 如革兰氏阴性菌细菌膜的主要糖脂成分LPS。另外， ficolin能识别并结合革兰氏阳性细菌如金黄色葡萄球菌， 肺炎链球菌的细胞壁成分磷壁酸［3， 4］。但是， 对于其他真菌和病毒， ficolin能否识别并结合， 现在还未知。Ficolin对某些高度糖基化的病毒是否也有作用尚不清楚， 相信随着研究的进展， 将更深入的阐明其结构， 功能及其作用机制。

　　本研究我们获得的重组ficolinA原核及真核表达质粒， 重组蛋白产物的获得， 和其抗体的制备， 为进一步研究ficolinA与免疫性疾病的相关性， ficolinA蛋白和抗体在感染性疾病和肿瘤等疾病发生中的功能， 及相关新型疫苗的研制而奠定基础。

参考文献

［1］ Mayilyan KR， Krarup A， Soghoyan AF， et al. MBL and Lficolin in components of the complement activation lectin pathway in schizophrenia［J］. Mol Immunol， 2007， 44(16): 3940-3941.

［2］ Gaboriaud C， Teillet F， Gregory LA， et al. Assembly of c1 and the MBLand ficolinMasp complexes structural insights［J］. Immunobiology， 2007， 212(4-5): 279-288.

［3］ Hummelshoj T， Nicole MT， Thielens NM， et al. Molecular organization of human Ficolin2［J］. Mol Immunol， 2007， 44(4): 401-411.

［4］ Kairies N， Beisel HG， Pablo FP， et al. The 2.0 A crystal structure of tachylectin 5A provides evidence for the common origin of innate immunity and the blood coagulation systems［J］. Pro Natl Acad Sci USA， 2001， 98(10): 13519-13524.

［5］ Lu J， Teh C， Kishore U， et al. Collectins and ficolins: Sugar pattern recognition molecules of the mammalian innate immune system［J］. Biochim Biophy Acta， 2002， 1572(2-3): 387-400.

［6］ Teh C， Le Y， Lee SH， et al. Mficolin is expressed on monocytes and is a lectin binding to NacetylDglucosamine and mediates monocyte adhesion and phagocytosis of Escherichia coil［J］. Immunology， 2000， 101(2) : 225-232.

［7］ Liu Y， Endo Y， Homma S， et al. ficolinA and ficolin B are expressed in distinct ontogenic patterns and cell types in the mouse［J］. Mol Immunol， 2005， 42(11) : 1265-1273.

［8］ Endo Y， Liu Y， Kanno K， et al. Identification of the mouse Hficolin gene as a pseudogene and orthology between mouse ficolins A/B and human L/Mficolins［J］. Genomics， 2004， 84(4): 737-744.

［9］ Lu J， Teh C， Kishore U， et al. Collectins and ficolins: Sugar pattern recognition molecules of the mammalian innate immune system［J］. Biochim Biophys Acta， 2002， 1572(2-3): 387-400.

［10］ Ander K， Uffe BSS， Misao M， et al. Effect of capsulation of opportunistic pathogenic bacteria on binding of the pattern recognition molecules mannanbinding lectin， Lficolin， and Hficolin［J］. Infect Immun， 2005， 73(2): 1052-1060.

［11］ Lynch NJ， Roscher S， Hartung T， et al. Lficolin specifically binds to lipoteichoic acid， a cell wall constituent of germpostive bacteria， and activates the lectin pathway of Complement［J］. J Immunol， 2004， 172(2): 1198-1202.

［12］ Ma YG， Cho MY， Zhao MY， et al. Human mannosebinding lectin and Lficolin function as specific pattern recognition proteins in the lectin activation pathway of complement［J］. J Biol Chem， 2004， 279(24): 25307-25312.