草木犀石油醚提取物对NFκB和血红素氧合酶1表达的影响

　　　　作者：庞然， 张淑玲， 赵雷， 刘双林， 董继华， 陶君彦

【摘要】 目的: 探讨草木犀的石油醚提取物在炎症中的作用。方法: 通过LPS干预RAW264.7 细胞系建立炎症细胞模型， 免疫细胞化学法检验NFκB的表达及分布变化， 实时荧光定量RTPCR法检测血红素氧合酶1（HO1）的基因表达， Western blot法测定HO1的蛋白表达量。结果: 免疫细胞化学法结果显示药物干预时胞质被染为棕色， NFκB多分布在胞质未被激活; 仅有LPS干预时， 胞核被染为棕色， NFκB集中分布在细胞核表达增强。药物提取物干预后HO1的mRNA表达水平明显升高， 且呈剂量依赖型关系; Western blot结果显示药物干预后HO1的蛋白表达水平也明显升高。结论: 草木犀的石油醚提取物通过抑制NFκB的激活， 同时促进HO1的释放而发挥一定的抗炎作用。

【关键词】 草木犀; 石油醚; RAW 264.7细胞系; NFκB; 血红素氧合酶1

　　草木犀， 豆科(Leguminosae)草木犀属(Melilotus) 1年生或2年生草本植物， 是临床用于抗炎的一种中草药。然而， 草木犀产生抗炎作用的分子生物学机制还不明确。本实验中拟通过LPS刺激 RAW 264.7小鼠巨噬细胞系建立炎症细胞模型［1］， 并采用免疫细胞化学法、 实时荧光定量RTPCR法﹑Western blot法对草木犀提取物在炎症中的作用进行的研究。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 RPMI1640、 TRIzol 购自Gibico公司; LPS(Escherichia coli O111: B4)和MTT购自Sigma公司; HO1羊抗鼠多克隆抗体购自R&&D Systems公司; 兔抗鼠多克隆抗体NFκB p65 IgG抗体购自Santa Cruz公司; MMLV逆转录酶、 dNTP购自Promega公司; SYBR Green 购自Biotium公司; Oligo(dT18)及引物由Invitrogen公司合成。草木犀于2006年8月在陕西陇县采集， 经陈科力教授（湖北中医学院）鉴定后保存于湖北中医学院药学部的植物样本库中。小鼠巨噬细胞系RAW 264.7 购自中国典型培养物保藏中心。

　　1.2 方法

　　1.2.1 草木犀石油醚提取物的制备 取50 g风干的草木犀磨成粉末， 用700 mL/L乙醇于85℃提取3次(1次500 mL， 每次 1.5 h)， 真空过滤浓缩提取液， 用去离子水稀释至1 g/mL（药材∶水）浓度。取5 mL浓缩液至100 mL的分液漏斗中， 连续石油醚提取直至其干重达0.425 g。用RPMI1640培养液将其稀释成3种浓度10 mg/L、 5 mg/L和1 mg/L备用。

　　1.2.2 细胞培养 小鼠巨噬细胞系RAW264.7使用RPMI1640培养液（加入100 U/mL青霉素， 100 mg/L链霉素和100 mL/L胎牛血清）， 50 mL/L CO2培养箱中37℃培养。

　　1.2.3 细胞模型的建立和干涉 LPS处理前24 h将细胞接种于6、 24或96孔板上， 24 h后细胞贴壁后弃上清， 加入含LPS10 g/L的培养液和不同浓度的提取物， 作用不同时间后收集细胞， 分别使用免疫细胞化学法， 实时荧光定量RTPCR法， Western blot法检测。

　　1.2.4 实验分组 实验共分4组。(1)阳性对照组: 地塞米松(DM) 0.5 g/L作阳性对照; (2)阴性对照组: 黄芪多糖(APS)100 mg/L作为阴性对照; (3)空白对照组: 只用10 g/L的LPS处理而不加药物干预; (4)正常对照组: 不用LPS处理也不加药物干预。

　　1.2.5 药物细胞毒性的检测 用MTT法， 在终止细胞培养前4 h加入20 μL MTT溶液（浓度5 g/L， pH7.4）， 终止细胞培养后每孔加入150 μL DMSO， Spectramax 250全自动定量绘图酶标仪测定A490值。细胞病变效应（cytopathic effect， CPE）检测， 细胞在提取液中培养24 h后在显微镜下观察细胞形态以检测细胞病变。

　　1.2.6 NFκB的检测 利用免疫细胞化学法(SP)检测NFκB的表达及分布变化。将盖玻片置于培养板中， 并将细胞接种于培养板， 待细胞爬片后， 药物干预细胞2 h。PBS洗涤， 4℃丙酮固定10 min; 30 mL/L过氧化氢甲醇溶液孵育20 min以封闭内源性过氧化物酶; 10 mL/L Triton X100 37℃ 5 min， PBS洗涤; 加入山羊血清室温孵育20 min; 然后加入兔抗鼠多克隆抗体NFκB p65 IgG抗体（1∶200）， 4℃冰箱过夜， PBS洗涤; 加入二抗（生物素化羊抗兔IgG， 1∶400）， 37℃ 30 min， PBS洗涤; 加入HRP结合链霉亲合素（1∶400）， 37℃ 30 min， PBS洗涤; DAB/h3O2显色， 苏木素衬染， 常规脱水、 透明、 封片。

　　1.2.7 血红素加氧酶1 mRNA水平的检测 实时荧光定量RTPCR法检测HO1的基因表达。细胞干预18 h后提取RNA检测HO1的基因表达量。细胞总RNA提取采用TRIzol试剂提取法， 具体方法参照说明书。将RNA保存在-80℃备用。采用ABI7700序列检测仪。引物序列: MusHO1: Forward: 5′CACAGATGGCGTCACTTCGTC3′， Reverse: 5′GTGAGGACCCACTGGAGGAG3′。Musβactin: Forward: 5′ GCTACAGCTTCACCACCACAG 3′， Reverse: 5′ GGTCTTTACGGATGTCAACGTC 3′。RNA经逆转录反应合成cDNA， RT及PCR反应体系按试剂盒说明书进行。实验结果采用ABI7700自带软件对数据自动分析后， 用所给Ct值应用公式Folds = 2-ΔΔCt进行基因表达差异分析［2］。

　　1.2.8 HO1蛋白水平的检测 Western blot法检测细胞中药物干预前后HO1的蛋白表达量的变化。细胞干预24 h后， 冷PBS洗涤， 加入细胞裂解液， 冰上孵育15 min， 细胞刮刮下并收集裂解液， 10 000 r/min 4℃ 10 min， 取上清保存于-20℃。用BCA法测定蛋白质浓度， 取相同量蛋白质用于100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳; 转移至硝基纤维素膜50 g/L 脱脂奶粉溶液37 ℃封闭1 h; 羊抗鼠HO1多克隆抗体(1∶200) ， 4℃孵育过夜， 洗膜; 应用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶200）室温孵育1 h， 再加入化学发光显色剂显色， X光片曝光显影， 凝胶成像分析系统扫描， pro3.0软件半定量分析。

　　1.2.9 统计学分析 应用SPSS12.0统计分析软件包， 采取单因素方差分析对实验数据进行处理， 以P&<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 药物对细胞的毒性 MTT实验结果显示3种浓度（10 mg/L、 5 mg/L和1 mg/L）药物干预细胞24 h后对细胞活性没有明显影响。CPE结果亦如此（图1）。

　　2.2 药物对NFκB的抑制效果 免疫细胞化学法结果显示: 药物干预时， 胞质被染成棕色（图2A～C）， DM干预时， 胞质被染成棕色（图2D）， 表示NFκB多分布在胞质未被激活; APS干预时， 胞核被染成棕色（图2E）， 仅有LPS干预时， 胞核被染成棕色（图2F）， 表示NFκB集中分布在细胞核表达增强， 说明APS、 LPS能诱导其向细胞核转位， 使NFκB活化。

　　2.3 药物干预前后HO1的mRNA水平 药物提取物干预后HO1水平明显升高， 并且药物浓度越高， HO1水平越高， 呈现一个剂量依赖型关系（图3）。

　　2.4 药物干预前后HO1的蛋白水平 Western blot结果显示药物干预后HO1的蛋白水平明显升高（图4）， 之间的差异有统计学意义(P&<0.01)。

　　3 讨论

　　巨噬细胞在炎症的启动过程中起着非常关键的作用， 它通过激活机体的免疫系统， 释放细胞因子、 具有生物活性的脂类介质及活性氧等一系列炎症介质参与炎症反应［3］。根据其对炎症反应的促进或抑制效应的不同， 这些炎症介质大致上可分为两类: 促炎介质和抗炎介质， 两者的比例关系及动态变化是决定炎症转归的关键因素［4］。当细胞面临有毒性的化学物质或病原体侵袭的时候， 机体的免疫系统会释放出NFκB。NFκB是调控众多炎症基因表达的关键转录因子， 其通常以非活性状态存在于细胞质中， 当细胞受到TNF、 弗波脂等刺激时， NFκB得以活化并从细胞质易位到细胞核， 启动多种炎症基因表达， 使大量的炎性细胞浸润于炎症部位［5］ 。NFκB发生核转位是一些免疫和炎症反应的重要步骤， 应用NFκB抑制剂以减少炎症介质的产生成为治疗炎症的新思路。炎症反应过程中， 在炎症介质产生的同时抗炎因子HO1也被分泌和活化。HO1是催化血红素降解的限速酶， 从而生成胆绿素、 游离铁和CO。研究表明， 它们不仅能清除机体的活性氧， 还能抑制多种促炎介质的产生， 促进多种抗炎介质的表达， 并且拮抗一些炎症介质的细胞毒效应［6］。

　　本课题组的前期研究已证实， 草木犀石油醚提取物能通过抑制促炎介质和细胞因子TNFα、 IL1、 IL6、 NO的产生发挥抗炎作用。而这些促炎介质和细胞因子都受NFκB的调控， 这就提示草木犀石油醚提取物可能通过抑制NFκB信号通路而抑制LPS所致巨噬细胞高水平表TNFα、 IL1β等发挥抗炎作用。本实验显示LPS刺激细胞后NFκB得以活化并向核内转位， 而药物干预后NFκB以非活性状态存在于胞质中未被激活， 进一步证实了草木犀石油醚提取物能通过抑制NFκB活化发挥抗炎作用。同时， 草木犀石油醚提取物也对抗炎介质产生一定的影响。实验显示草木犀石油醚提取物能促进HO1的表达和释放， 且该作用呈剂量依赖性。以上结果表明， 草木犀石油醚提取物能通过抑制NFκB活化， 同时， 促进HO1的基因表达和释放而发挥抗炎作用。本实验选用DM和APS分别作为阳性和阴性对照。DM是传统的抗炎药物; APS是临床上用于增强免疫的免疫调节剂， 能够增强促炎因子的释放［7］。结果显示， 一定浓度的DM可以显著降低NFκB活化， 而APS则没有这方面的作用， 这与文献报道的结果基本一致［8］。

　　我们从分子水平探讨了草木犀石油醚提取物的体外抗炎活性及其可能的分子机制。通过本研究发现， 草木犀石油醚提取物能抑制促炎介质的表达， 并促进抗炎介质的表达， 使得促炎/抗炎介质的比例偏向抗炎一方， 从而产生广泛的抗炎作用。

参考文献

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