抗人转录因子TFDP3和TFDP1多肽抗体的制备

　　　　 作者：田婵， 李云燕， 乔欢， 张毓， 陈慰峰

【摘要】 目的: 制备兔抗人转录因子TFDP3、 TFDP1的多克隆抗体， 并鉴定其反应性及特异性。方法: 选择TFDP3和TFDP1差异较大肽段， 利用人工合成多肽免疫家兔， 采用真核表达载体瞬时转染HEK293细胞表达TFDP3和TFDP1真核蛋白， 通过Western blot分析抗体的反应性和特异性。结果: 通过氨基酸序列比对选择TFDP3 1726， TFDP1 1732氨基酸残基合成多肽， 制备了兔抗人TFDP3、 TFDP1多肽抗体， Western blot检测显示， 抗TFDP3抗体可以特异性识别TFDP3， 而抗TFDP1抗体既可识别TFDP1又可与TFDP3结合。结论: 制备了兔抗人TFD31和TFDP1的多肽抗体， 且TFDP3抗体与TFDP1无交叉反应。

【关键词】 TFDP3; TFDP1; 多肽抗体

　　人转录因子（transcriptional factor， TF）DP3最初是通过重组cDNA表达文库的血清学分析法（serological analysis of recombinant cDNA expression library， SEREX)从人肝癌组织中筛选出的新肿瘤睾丸（cancertestis， CT）抗原， 即HCA661［1］。TFDP3全长405个氨基酸， 位于人染色体Xq26.2。随着研究的深入， 发现其还是人转录因子DP家族成员［2］， 故由此命名TFDP3。目前已知人DP家族包括TFDP1和TFDP2， 其生物学功能主要是与转录因子E2F16结合形成异源二聚体， 大大增加E2F结合DNA的能力， 从而激活其下游靶基因的转录。不同的E2F/DP二聚体激活不同基因的转录， 主要取决于E2F， 其效应涉及DNA合成、 复制， 细胞周期进展， 细胞凋亡， DNA损伤及修复等。其中E2F13/DP可促进细胞从G1期进入S期， 并促进细胞增殖［3］。而E2F1/DP可以在血清饥饿或射线照射后诱导细胞凋亡［4］。TFDP3作为DP家族新成员， 与已知DP功能相左， 虽然可以和E2F16结合形成二聚体， 但是并不能提高E2F结合DNA的能力， 从而抑制了E2F转录激活活性， 并因此抑制了E2F诱导的细胞周期进程和细胞增殖。此外， TFDP3还能抑制E2F1介导的血清饥饿和γ射线引起的细胞凋亡， 且该作用可能通过p53通路起作用［5］， 对E2F生物学活性起到重要的调节作用。由于TFDP3与TFDP1全长只相差5个氨基酸， 且氨基酸序列相似性达到82％， 所以， 为鉴别两种蛋白， 深入研究TFDP3， 我们制备了TFDP3和TFDP1多肽抗体， 并对其特异性进行了鉴定。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 人胚肾细胞系HEK293由本实验室冻存; 家兔（雄性， 体质量≥2.5 kg的大耳白品系）由北京大学医学部动物部提供并饲养。TRIzol试剂购自GibcoBRL公司， RTPCR试剂盒由Clontech（Clontech. Palo Alto， CA）公司提供， 免疫用多肽由杭州中肽生化有限公司合成。抗FLAG小鼠单克隆抗体（mAb）M2购自Sigma公司， 碱性磷酸酶（AP）标记的抗小鼠和抗兔的二抗由Promega公司提供， 显色剂NBT/BCIP系Boehringer mannlteim公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 多肽的选择 通过NCBI网站将TFDP1与TFDP3的蛋白序列进行比对（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi）， 寻找二者有连续差异的肽段。

　　1.2.2 多肽抗体制备 将所选多肽与铜蓝蛋白耦联后， 与福氏佐剂等量混合作为抗原， 多点皮下注射免疫家兔， 并分别于初次免疫后的第21、 42、 70天加强免疫。其中前2次抗原量为300 μg/只， 后两次抗原量为150 μg/只。为防止因为遗传背景或健康状况等原因导致的抗体差异， 每种抗原免疫两只不同的家兔， 以获得最佳的抗体。经Western blot检测后， 产生抗体的家兔经颈动脉插管放血处死， 分离血清获得抗体。

　　1.2.3 多肽抗体反应性及特异性检测 免疫前和末次免疫后7 d取家兔耳缘静脉血2 mL， 分离血清后通过Western blot实验鉴定是否产生相应抗体。以真核表达的TFDP1和TFDP3蛋白进行SDSPAGE电泳， 相应多肽免疫所得的兔血清1∶200稀释作为一抗进行杂交， 阳性对照一抗采用抗FALG mAb M2。为检测抗体特异性， 还将抗体与蛋白进行交叉反应， 其他步骤见

参考文献

［5］。处死家兔后所得血清重复上述实验。

　　1.2.4 TFDP3和TFDP1 mRNA的制备及RTPCR检测 HEK293细胞以50 000/cm2的密度铺于直径100 mm细胞培养盘， 以含有100 mL/L新生小牛血清（NCS）的DMEM培养基培养， 24 h后采用磷酸钙沉淀法分别转染10 μg表达蛋白全长的pcDNA3TFDP3flag， pcDNA3TFDP1flag质粒［2］， 转染后48 h用TRIzol试剂提取总RNA， 采用RTPCR方法检测TFDP3、 TFDP1在mRNA水平上的表达， 所用引物分别为: TFDP3前向: 5′TAC ACT CGG CCT GGA AGA ATT G3′， 反向: 5′TCT TCC TCC TCG ACT GCT G3′; 反应条件: 94℃ 30 s， 60℃ 30 s， 72℃ 90 s， 35个循环， 72℃延伸10 min; 所得条带: 1 244 bp; TFDP1前向: 5′ATG GCA AAA GAT GCC GGT CTA ATT G3′， 反向: 5′TCG TCC TCG TCA TTC TCG TTG3′; 反应条件: 94℃ 30 s; 55℃ 30 s; 72℃ 90 s， 35个循环， 72℃延伸10 min， 所得条带1 229 bp。阳性对照采用相应质粒为模板， 阴性对照以水为模板。

　　1.2.5 TFDP3和TFDP1蛋白的制备及Western blot检测 在提取转染HEK293细胞RNA的同时， 还提取了细胞总蛋白， 采用Western blot方法检测两个分子蛋白水平上的表达， 抗FALG mAb M2作为阳性对照， 阴性对照不加一抗， 实验方法如文献［5］所述。

　　2 结果

　　2.1 多肽的选择和合成 TFDP3和TFDP1在氨基酸水平上有75.2％的一致性， 通过蛋白序列比对（图1）， 发现两者不一致的氨基酸残基大多散在分布， 只有始于17位氨基酸的肽段LMDENQTSRP（TFDP3）和FIDQNLSPGKGVVSL（TFDP1）差异明显， 故选择此两段多肽作为抗原进行免疫， 并分别标注为L和F， 其免疫的不同家兔分别命名为L1、 L2、 F1和F2。

　　2.2 真核TFDP1、 TFDP3蛋白表达鉴定 HEK293细胞不表达内源性TFDP3， 故将pcDNA3TFDP3flag质粒转染后， 提取瞬时表达的真核蛋白， 鉴定抗体的反应性， 同法得到TFDP1蛋白。首先在转染后48h提取细胞的总RNA， 用RTPCR方法检测了TFDP1和TFDP3在转录水平上的表达（图2A）， 在1 200 bp左右与阳性对照一致的位置出现了扩增条带， 说明两个表达载体都进行了转录。随后采用Western blot方法检测了两种蛋白的表达（图2B）， 在相对分子质量（Mr）约45 000的位置都出现了条带， 即外源瞬时表达的TFDP1和TFDP3蛋白。

　　2.3 多肽抗体反应性和特异性鉴定 采用Western blot方法检测抗体的反应性。图3所示， 注射TFDP1来源的F肽段所用家兔F1、 F2血清在免疫前无特异性条带， 而免疫后在与阳性对照相同的位置出现明显条带， 说明该肽段免疫家兔成功产生了抗TFDP1的抗体。同样， 注射TFDP3来源的L肽段的家兔L1、 L2， 其血清在免疫前也无明显条带， 而免疫后在特定位置出现条带。该结果显示L肽段也成功免疫家兔， 产生了可识别TFDP3的抗体， 但L2家兔血清反应后条带不明显， 说明产生抗体的浓度较低。当用L1、 L2兔血清与TFDP1蛋白反应， 未见任何条带， 说明抗TFDP3的抗体只能识别TFDP3蛋白， 而不能识别TFDP1。同法检测TFDP1抗体与TFDP3蛋白的交叉反应， 可见在与阳性对照一致的位置上出现条带， 说明抗TFDP1的多肽抗体既可以识别TFDP1， 又可与TFDP3反应。

　　3 讨论

　　TFDP3作为转录因子的研究已经逐渐深入， 但是其作为CT抗原， 除了已知在肝癌组织mRNA中有29.4％的表达率， 10例黑色素瘤组织有2例mRNA阳性外［1］， 其在癌组织中的蛋白表达及其病理学意义还不清楚。为深入研究TFDP3在肝癌、 黑色素瘤中表达的意义， 特异性识别TFDP3的抗体是必需的。TFDP1全长410个氨基酸， 比TFDP3多5个， 两者氨基酸一致性达到75.2％， 且有差异的氨基酸散在分布， 蛋白全长免疫动物所得抗体极易造成抗体的交叉反应。目前已有市售的TFDP3商品化单克隆及多克隆抗体， 但是其并未提供相关实验结果证明该抗体不识别TFDP1。故本研究从两个分子相对应的位置选取差异性较大的肽段免疫家兔， 得到特异性识别TFDP3的多肽抗体， 为今后深入研究其功能提供了有效工具。

　　来源于TFDP1的多肽F产生的抗体与TFDP3存在交叉反应， 可能的原因是， 其肽段中有三段连续的氨基酸残基IDQ、 QNL、 VSL存在于TFDP3的蛋白序列中， 对应于5355、 198200、 57位氨基酸残基。这些氨基酸的极性及酸碱性都有所不同， 分别是IDQ: 非极性－酸性－极性; QNL: 极性－极性－非极性; VSL: 非极性－极性－非极性。一般认为在蛋白质的二级、 三级结构中， 亲水性──极性氨基酸残基位于表面， 而输水性， 即非极性氨基酸包埋于蛋白的内部。蛋白质或多肽的极性、 非极性氨基酸的数量、 比例与抗原位点密切相关， 尤其是亲水性氨基酸出现在抗原表位中的几率更大。TFDP3中这三段不同位置的短肽都包含至少一个极性氨基酸， 所以它们很有可能在空间上形成与F肽段相似的结构表型， 从而与抗F多肽的抗体产生交叉反应。

　　虽然来源于TFDP3的多肽L也存在3个连续的氨基酸残基SRP与TFDP1蛋白248250位氨基酸一致， 但是实验结果显示抗L多肽的抗体并不识别TFDP1。可能由于L多肽只有这3个连续的氨基酸残基与TFDP1一致， 且其中只有一个极性氨基酸（SRP: 极性－碱性－非极性）， 不足以形成一个独特的抗原表位， 所以L多肽免疫家兔产生的抗体特异性较高， 只能识别TFDP3， 而不能与TFDP1反应。

　　综上， 我们得到了可以特异性识别TFDP3的多肽抗体， 可应用于免疫组化、 免疫荧光、 ELISA及Western blot等实验鉴定癌组织和细胞系内源表达的TFDP3蛋白。

参考文献

［1］ Wang Y， Han KJ， Pang XW， et al. Large scale identification of human hepatocellular carcinomaassociated antigens by autoantibodies［J］. J Immunol， 2002， 169(2): 1102-1109.

［2］ Qiao H， Di Stefano L， Tian C， et al. Human TFDP3， a novel DP protein， inhibits DNA binding and transactivation by E2F［J］. J Biol Chem， 2007， 282(1): 454-466.

［3］ DeGregori J， Johnson DG. Distinct and overlapping roles for E2F family members in transcription， proliferation and apoptosis［J］. Curr Mol Med， 2006， 6(7): 739-748.

［4］ Kowalik TF， DeGregori J， Schwarz JK， et al. E2F1 overexpression in quiescent fibroblasts leads to induction of cellular DNA synthesis and apoptosis［J］. J Virol， 1995， 69(4): 2491-2500.

［5］ Tian C， Lv D， Qiao H， et al. TFDP3 inhibits E2F1induced， p53mediated apoptosis［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2007， 361(1): 20-25.