从大容量抗体库中筛选抗TNFα人单链抗体

　　　　 作者：王欲晓， 乔媛媛， 周丽君， 王琰

【摘要】 目的: 从天然的单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗TNFα的人单链抗体（scFv）。方法: 以TNFα为抗原， 通过 “吸附洗脱扩增”过程从大容量抗体库中筛选特异性抗体， 对其抗原结合活性和序列进行分析鉴定 。结果: 经过4轮筛选， 获得62个与TNFα结合的阳性克隆， 其中27个特异性结合的克隆， 指纹分析有7种不同的可变区片段; 其中5种获得可溶性表达; 基因序列分析表明其轻重链分属VλⅠ和VHⅣ亚群。结论: 利用单链大容量抗体库技术可以不经免疫制备获得特异性抗TNFα的scFv， 为今后的研究和应用提供依据。

【关键词】 大容量噬菌体抗体库; TNFα; 噬菌体抗体

　　肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α， TNFα）是炎症反应的主要介质， 研究发现TNFα水平的升高与多种病理过程有关。如类风湿性关节炎(RA)、 感染及创伤引起的休克、 炎症性肠病(Crohn’s)及移植物抗宿主病等。抗TNFα单克隆抗体(mAb)对这些病理过程可以起拮抗作用， 从而可能对许多疾病有治疗作用［1］。目前国外已将抗TNFα抗体作为治疗RA、 Crohn’s等的药物正式进入临床并显示出良好的应用前景。由于鼠源mAb具有异源性， 限制了其在人体内的应用， 人抗体的制备难度很大。抗体库技术的出现为人抗体的制备提供了有效手段。我们实验室构建了大容量噬菌体抗体库， 并从中筛选出多种针对不同抗原的特异性抗体［2］。本实验拟从大容量噬菌体抗体库中筛选出抗TNFα的人单链抗体(scFv)， 为今后的研究和应用提供依据。

　　1 材料和方法

　　1．1 材料 大肠杆菌菌株XL1Blue、 Bs1365、 无琥珀抑制子的大肠杆菌菌株HB2151和VCSM13为本室保存; 大容量噬菌体抗体库为本室构建， 详细过程见文献［2］; 重组人TNFα抗原由我实验室表达和纯化; 限制性内切酶为TaKaRa公司产品; 卵清蛋白（OA）和铁蛋白（Fer）购自Sigma公司、 各种酶标抗体购自Promega公司和Sigma公司; 抗原管（Immunotube）购自丹麦NUNC公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大容量噬菌体抗体库工作库的制备 原始噬菌体抗体库以100∶1的比例（multiplicity of infection， MOI=100）超感染BS1365细胞， 37℃水浴保温1 h， 使多副本载体进入同一个细胞［2， 3］， 加2YT至400 mL， 补足Amp 100 mg/L振荡培养至OD=0.5左右加5 mL辅助病毒VCSM13(pfu=1.7×1012)， 30℃培养过夜， 次日收集噬菌体抗体库， 测定滴度。再以MOI≤1的比例感染1000 mL对数生长期的XL1Blue菌， 37℃静止30 min， 取少许铺含Amp的培养盘计算库容， 补足Amp， 加入10 mL VCSM13， 30℃过夜， 次日回收上清， 常规PEG沉淀， 获得工作库。

　　1.2.2 抗TNFα抗体的筛选 将TNFα用0.05 mol/L碳酸盐Buffer稀释至100 mg/L， 以1 mL包被免疫管， 4℃过夜， 次日用30 g/L脱脂奶粉封闭2 h， 加入1 mL噬菌体抗体库（约1×1013个CFU）， 37℃孵育2 h， 以含0.5 mL/L Tween20的PBS洗15次， （第1轮洗15次， 以后洗涤20次以上）， 用2种方法回收结合于固相的噬菌体抗体， 先加入1 mL新鲜XL1Blue菌直接感染， 37℃孵育15 min， 转入 10 mL SB培养液中; 再将细菌感染回收后的免疫管中加入1 mL洗脱液（0.1 mL HCl， 以甘氨酸调至pH至2.2）37℃静置15 min再进行洗脱回收。用吸管将洗脱液吸出后， 加入45 μL 2 mol/L Tris中和， 再加入2 mL XL1Blue细胞37℃静置15 min， 加入7 mL的SB培养液。从2次回收的菌液分别取出适量铺氨苄青霉素培养盘测定滴度（CFU）， 其余菌液37℃培养3 h， 扩大体积到100 mL， 加入1.7×1012pfu辅助病毒VCSM13， 30℃振荡培养过夜。每轮筛选后均测定次级库的滴度， 并计算噬菌体抗体的投入产出比（回收率）， 作为特异性噬菌体抗体富集的指标。次日回收上清， 常规PEG沉淀， 所得次级噬菌体抗体库再进行下一轮的筛选［4， 5］。

　　1.2.3 噬菌体抗体的筛选 从筛选第三、 第四的培养盘随机挑取集落在含有Amp的2YT培养液中过夜， 第2天取30 μL细菌到1 mL SB培养液中， 37℃培养至对数生长期， 加入辅助病毒VCSM13， 30℃培养过夜， 收取上清即得到噬菌体抗体。

　　1.2.4 ELISA试验鉴定噬菌体抗体 将抗原稀释至10 mg/L， 以50 μL包被ELISA板， 1 h后弃去孔内液体， 用30 g/L脱脂奶PBS封闭后加入噬菌体抗体液， 37℃孵育1 h， 用0.5 g/L Tween20PBS洗涤3次， 加入HRP抗M13鼠mAb进行反应， 洗涤后加入OPD底物显色， 读取A490值。

　　1.2.5 可变区基因的多样性分析（DNA指纹） 从筛选到的阳性克隆提取质粒， 以此为模板， PCR扩增scFv基因， PCR产物用CL6B凝胶（Phamacia）微型柱离心纯化， 再用限制性内切酶Mva Ⅰ 37℃消化过夜， 取10 μL进行聚丙烯酰胺凝胶电泳， EB染色后通过比较带型推测其是否为相同的基因。

　　1.2.6 可溶性抗TNFα抗体的表达 将ELISA鉴定出的特异性阳性的TNFα噬菌体抗体一定倍数稀释后感染大肠杆菌HB2151， 37℃孵育15 min铺培养盘。挑取单个集落在含有Amp的2YT培养液中过夜， 第2天取30 μL细菌到1 mL SB培养液 中， 37℃培养至对数生长期， 加入IPTG至1 mmol/L， 30℃培养过夜， 收取上清即得到可溶性体抗体。

　　1.2.7 可溶性抗体的鉴定 将抗原稀释至10 mg/L， 以50 μL包被ELISA板， 1 h后弃去孔内液体， 用30 g/L脱脂奶PBS封闭后加入噬菌体抗体液， 37℃孵育1 h， 用0.5 g/L Tween20PBS洗涤3次， 加入抗V5二抗进行反应， 0.5 g/L Tween20PBS洗涤3次后加入HRP鼠抗人Fab， 37℃孵育1 h 后OPD底物显色， 读取A490值。

　　1.2.8 竞争抑制性ELISA 将TNFα抗原包被ELISA板， 30 g/L脱脂牛奶封闭后， 加入噬菌体抗体25 μL的同时， 分别加入不同浓度25 μL的TNFα的抗原和无关抗原， 37℃孵育2 h， 0.5 mL/L Tween/PBS洗涤后， 加入50 μL/孔HRP标记抗噬菌体抗体（1∶5 000）， 37℃孵育1 h后OPD显色。抑制率的计算: 抑制率=(对照A495值-实验组A495值)/对照组A495值×100%， 　对照组A495值为不加竞争抑制剂时所测值， 实验组为加抑制剂时所测值。

　　2 结果

　　2.1 工作库的制备 从原始噬菌体抗体库中取出7×1012CFU的噬菌体颗粒以高比例（multiplicity of infection， MOI=100/1）感染20 mL BS1365菌， 通过creloxp介导的定位重组使同一细胞内不同载体之间的轻、 重链随机交换配对， 所获噬菌体上清再按低比例(MOI≤1)感染1 000 mL XL1Blue菌， 获得库容为7×1010的大容量人源噬菌体抗体库， 所获抗体库滴度为5×1015CFU/L。

　　2.2 抗TNFα噬菌体抗体的筛选 经过4轮的筛选， 测定每轮洗脱回收的噬菌体滴度， 发现有一定的富集。从第三， 第四菌落中随机挑取100个克隆， 制备噬菌体抗体。ELISA结果表明， 62个能与TNFα抗原结合， 随后用卵清蛋白(OA)、 铁蛋白（Fer）作为对照鉴定， 特异性结合的克隆为27个。

　　2.3 可变区基因的多样性分析（DNA指纹） 对获得的27个阳性克隆进行了DNA指纹分析， 电泳结果显示共获得了7种不同的指纹图谱（图1）。其中1、 4、 5为相同指纹。

　　2.4 可溶性抗体的表达及特异性鉴定 将筛选出的7种特异性克隆感染大肠杆菌HB2151， 诱导表达后取细菌上清制备可溶性抗体， 进行特异性鉴定。非抑制表型菌HB2151中， scFv以游离可溶的形式， 在GⅢ信号肽介导下分泌表达。结果显示7株阳性克隆中有5株克隆ELISA检测有活性。与TNFα反应的分别为: 1.15±0.03、 0.97±0.02、 1.02±0.01、 0.97±0.02、 1.02±0.04; 而与无关抗原OA和Fer均无反应。

　　2.5 ELISA竞争抑制实验 为进一步核实所筛选的抗TNFα scFv的特异性， 进行了竞争抑制实验。以TNFα包被ELISA板， 以游离的TNFα与无关蛋白(Fer)作为竞争抗原进行ELISA竞争抑制实验(图２)， 显示获得的5株抗体均能够同游离的TNFα产生抑制效应， 并且抑制效应和游离的抗原的剂量相关。而与无关抗原没有抑制效应。说明从大容量抗体库中筛选到的抗体是特异性的抗TNFα抗体。

　　2.6 可变区基因的序列测定 挑出5个阳性克隆测定其可变区基因的序列， 分析发现轻重链可变区基因均来自同一亚群: 重链为VHⅣ亚群; 轻链可变区属于VλⅠ亚群。进一步分析发现几株抗体的同源性很高。不排除其来源于同一胚系基因的可能。

　　3 讨论

　　TNFα是主要由巨噬细胞产生、 具有较广泛生物活性的细胞因子。经多方面研究， 发现其参与多种病理过程。具有中和活性TNFα抗体能对此病理过程起拮抗作用， 从而对多种疾病有治疗作用。目前， 欧美己将抗TNFα抗体作为药物（adalimumab、 Remicade）正式用于临床， 治疗病程严重的RA、 Crohn’s， 显示出良好的应用前景。

　　传统的杂交瘤技术是制备mAb的主要手段， 但由于不能直接对人体进行免疫， 制备人mAb的研究进展缓慢。而鼠mAb由于其异源性而限制了在人体内的应用， 近得发展起来的噬菌体抗体库技术将人抗体基因克隆到噬菌体载体中， 利用其表面呈现的特点可以方便地用不同的抗原筛选出相应的人抗体， 为人mAb的制备提供了有效手段， 尤其是通过构建大容量、 具有良好多样性的抗体库， 不经免疫， 使抗体工程发展到了一个新阶段。第一个运用噬菌体抗体库制备的抗TNFα人mAb（阿达木mAb， Humira）， 已于2002年12月31日获美国食品和药品管理（FDA）批准， 作为治疗RA的正式药物进入临床并疗效显著， 印证了用大容量噬菌体抗体筛选人源抗体的可行性。

　　小分子抗体scFv是由VH和VL中间加一段Linker构成， 与完整抗体及抗体的Fab段相比具有分子量小、 免疫原性低、 穿透力强等优点， 利于作为“导向载体”等应用于人体。在构建噬菌体抗体载体时， 在抗体基因与GⅢ基因之间引入了一个琥珀终止密码子， 在含有琥珀抑制基因的宿主菌中， 抗体基因和GⅢ成为一个开放阅读框架， 这时抗体就能借助噬菌体外壳蛋白呈现在噬菌体表面， 而在不带有琥珀抑制基因的宿主菌HB2151中， 由于终止密码子的存在， 抗体分子不与GⅢ融合表达， 在信号肽介导下分泌到质周腔中进行折叠， 便产生了可溶性的抗体片段［6， 7］。将融合的噬菌体抗体转染大肠杆菌HB2151， 经IPTG诱导， 制备分泌有功能的可溶性抗体， 排除了噬菌体蛋白的干扰， 可获得确实可以和抗原特异结合的抗体基因。以往实验发现， 抗体可溶性表达后活性与噬菌体表达不完全一致， 我们推测可能是诱导条件发生了变化， 或表面表达的抗体片段受周围环境的影响， 立体构象发生了变化， 可能造成结合活性发生了改变［5， 8］。本实验结果同样出现了抗体可溶性表达与噬菌体表达不一致的情况， 揭示在用噬菌体抗体库筛选特异性克隆时， 一定要核实其可溶性抗体的活性。本实验我们发现获得的6株阳性克隆， 尽管指纹图谱相差较大， 但序列分析发现其同源性很高， 其轻重链均属VλⅠ和VHⅢ亚群， 不排除是我们在构建大容量抗体库的过程中， 来源于同一胚系的基因在PCR扩增时发生突变所造成， 相关工作还在继续， 对此将有更深入的研究。此外抗体亲和力是治疗性抗体的重要参数， 大容量抗体库所获的抗体一般亲和力不高， 因此用噬菌体抗体库技术在体外进行抗体亲和力成熟已成为治疗行人抗体的重要平台， 我们将对所获克隆进行体外亲和力成熟实验以期获得具有临床应用前景的克隆。

参考文献

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［2］ 乔媛媛， 王 琰， 陈晓穗， 等. 大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定［J］. 中华微生物学和免疫学杂志， 2004， 24(3): 194-197.

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［4］ 王 琰， 刘群英， 化 冰， 等. 从人源性噬菌体抗体库分离出1株含有异常序列的抗HBsAg Fab克隆［J］. 中国免疫学杂志， 1998， 14(1): 115-119.

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