p27和TGFβ在大鼠肾间质纤维化中的表达及关系

【摘要】 目的: 研究单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠肾组织p27的表达， 同时观察TGFβmRNA在各组的变化， 探讨UUO模型中 TGFβ与p27的关系。方法: 60只SD大鼠随机分成假手术组（SOR）、 UUO模型组。于术后第7、 14、 21天分别处死各组大鼠10只。用HE染色动态观察肾脏病理变化， 免疫组织化学法测定p27的蛋白表达及动态变化， RTPCR法测定p27mRNA和TGFβmRNA的水平。结果: SOR组肾小管上皮细胞p27蛋白及肾皮质p27mRNA的表达均强， UUO组随着间质纤维化程度的加重， p27的表达逐渐减弱， 而TGFβmRNA随着肾间质纤维化程度的加重， 其表达呈上升趋势; UUO组TGFβmRNA与p27mRNA成负相关。结论: p27参与了UUO大鼠肾间质纤维化的发病过程; UUO大鼠肾间质纤维化模型中TGFβ促纤维化机制可能与p27的下调相关。

【关键词】 p27 转化生长因子β 纤维化 肾脏

　　肾间质纤维化几乎是所有慢性肾脏疾病进行性发展的最终共同通路， 是导致终末期肾病的主要病理基础。研究表明， 间质成纤维细胞及肾小管上皮细胞的异常增殖及凋亡， 造成细胞外基质（extracellular matrix）过多， 参与了肾间质纤维化过程［1］。近年来研究发现， 调节细胞增殖与凋亡的最终环节发生在细胞周期水平上， p27是一种细胞周期素依赖性激酶抑制剂， 它通过影响细胞周期基本过程来调节细胞的生长， 并可影响细胞凋亡［2］。众所周知， 转化生长因子β（TGFβ）是目前公认的促纤维化发生、 发展的关键因子之一， 且可通过诱导肾小管上皮细胞凋亡， 导致肾小管萎缩致肾间质纤维化［3］。而在肾间质纤维化过程中， p27的功能与TGFβ有关［4］。本研究中我们动态观察单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化模型中肾组织p27表达的变化， 同时观察TGFβ与p27的关系， 探讨慢性肾间质纤维化的发病机制， 并为其防治提供新的思路。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 小鼠抗大鼠p27单克隆抗体(mAb)购自美国Neomarker公司; KIT9001免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司; 逆转录试剂盒、 Taq DNA 聚合酶、 dNTP均购自美国Fermentas公司; p27及βactin引物， TGFβ及GAPDH引物均由上海生工生物工程公司合成。健康雌性SD大鼠均由中南大学湘雅医学院动物学部提供， 共60只， 月龄2月左右， 体质量（200±20）g， 生长良好， 普食喂养。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物的分组及单侧输尿管梗阻模型的建立 实验动物随机分为假手术组(shamoperated rats， SOR， n=30)和单侧输尿管结扎手术组(unilateral ureteral obstruction， UUO， n=30)。单侧输尿管结扎手术组造摸方法是在无菌条件下行大鼠左侧输尿管结扎术， 假手术组除不结扎离断输尿管外余处理同手术组。分别于手术后第7、 14、 21天每组各处死10只大鼠留取左肾标本。

　　1.2.2 免疫组化染色 采用SP法。4 μm石蜡切片脱蜡水化后经30 mL/L过氧化氢孵育25 min封闭内源性过氧化物酶， 微波修复15 min。羊血清封闭30 min后， 加入一抗(小鼠抗大鼠p27 mAb， 稀释浓度为1∶50)37℃孵1 h， 再依次加入抗原加强液及二抗(羊抗小鼠IgG); DAB显色， 苏木素复染后， 中性树脂封片。每次染色均用PBS替代一抗作为阴性对照， 用已知乳腺癌组织做阳性对照。

　　1.2.3 肾组织p27mRNA和TGFβmRNA的表达测定 总RNA提取及逆转录按试剂盒说明步骤进行。p27: 上游引物5′GTCTAACGGGAGCCCGAGCCTGG3′， 下游引物 5′GAAGGCCGGGTTCTTCTTGGGCG3′， 扩增长度为 560 bp， 根据文献设计［5］。βactin: 上游引物 5′GGCCAAGTCATCACTATTGG3′， 下游引物5′GGACTCATCGTACTCCTGC3′， 扩增长度为360 bp， 根据GenBank设计。TGFβ: 上游引物5′GGACTACTACGCCAAAGAAG3′， 下游引物5′TCAAAAGACAGCCACTCAGG3′扩增长度294 bp， 根据文献设计［6］。GAPDH: 上游引物5′CTACCCACGGCAAGTTCAAT3′， 下游引物5′GGATGCAGGGATGATGTTCT3′扩增长度501 bp， 根据GenBank， 用primer3软件辅助设计。0.5 mL的PCR反应管中依次加入下列反应液ddh3O 17.2 μL， 10×缓冲液2.5 μL， 25 mmol/L MgCl2 1.5 μL， 10 mmol/L dNTP 0.5 μL， p27或βactin(25 pmol/L)， 引物各1 μL， 5 U/μL Taq DNA聚合酶0.3 μL， cDNA 2.0 μL， 总体积25 μL， 短暂离心后， 加盖石蜡油25 μL， 预变性94℃ 5 min， 变性92℃ 60 s; p27退火温度为58.5℃， βactin 退火温度为52℃ 90 s ; TGFβ或GAPDH退火温度均为55℃ 60 s， 延伸72℃ 90 s 30个循环， 末次循环72℃延伸10 min。

　　1.2.4 结果观察 ①肾间质纤维化程度的判断: 低倍镜下单盲依序观察左上、 右上、 左下、 右下、 中间5个肾小管间质视野。按肾间质损伤8项指标评分: 肾小管上皮细胞空泡变性、 肾小管扩张、 肾小管萎缩、 红细胞管型、 蛋白管型、 间质水肿、 间质纤维化、 间质细胞浸润， 计算其均值， 作为该标本的肾小管间质损伤指数［7］。肾间质损伤指数越高， 纤维化程度越显著。②p27蛋白的表达: 每例切片在高倍镜(×400)下随机选20个肾小管间质， 计数每个视野阳性及总的细胞数， 折算成每200个总细胞数中阳性细胞数， 用作分析。平均阳性细胞数大于50%为强表达， 小于50%为低表达。③p27mRNA、 TGFβmRNA PCR扩增产物半定量分析: 取扩增液5 μL， 加1 μL上样缓冲液， 混匀后依次加入上样孔中， 同时加入DNA marker点样做对照同时电泳， 15 g/L琼脂糖凝胶(内含0.5 mg/L溴乙锭)恒压电泳。电泳完成后， 取出凝胶。放入凝胶成像分析系统成像， 电泳条带运用Band leader图像软件分析， 以目的基因与内参的电泳带平均光密度值比作为该例标本的基因表达的相对数值， 按照计量资料进行统计分析。

　　1.2.5 统计学分析 实验数据以x±s表示， 组间均数差异采用t检验。数据分析采用SPSS11.0统计分析软件。P&<0.05为具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 肾脏组织学改变 SOR组第7、 14、 21天肾脏未见病理改变。UUO组术后第7天近曲小管及远曲小管均明显扩张， 肾间质大量炎症细胞浸润， 肾间质宽度增加， 偶见肾小管萎缩; 第14天可见弥漫的肾小管萎缩， 皮质及近髓萎缩肾小管较多， 纤维化较明显; 第21天可见肾间质基质存积， 及广泛萎缩的肾小管， 纤维化明显。肾间质损伤指数评分， 结果显示， UUO组与SOR组比较， 肾间质损伤指数明显增高（P&<0.01）， 且随着时间点的延长， 肾间质损伤指数逐渐增高(P&<0.05， 表1)。

　　表1 各组大鼠肾间质损伤指数（略）

　　Tab 1 Renal interstitial injury index in deffrent groups

　　aP&<0.05 vs group of 14 d after UUO; bP&<0.01 vs SOR group; dP&<0.01 vs group of 7 d after UUO.

　　2.2 p27在肾小管中的表达 SOR组p27在肾小管上皮细胞的核或核浆呈强阳性表达， 在第7、 14、 21天均无明显变化。UUO组术后第7天， p27在肾小管上皮细胞的核或核浆呈强阳性表达， 与SOR组比较无统计学意义（P&>0.05）; 术后第14天， p27的表达明显降低， 与SOR组比较差异有统计学意义(P&<0.01); 术后第21天， p27的表达亦明显降低， 与SOR组比较差异有统计学意义(P&<0.01)， UUO组第14天与第21天 p27的表达比较无统计学意义(表2)。

　　表2 各组大鼠p27肾小管阳性细胞数(阳性细胞/200个细胞)（略）

　　Tab 2 The cell number of p27 positive expression in renal epithelia in deffrent groups (the number of positive cell /200 cells)

　　bP&<0.01 vs SOR group.

　　2.3 p27的RTPCR结果 RTPCR半定量检测结果显示， SOR组肾皮质p27mRNA呈强表达， 在第7、 14、 21天均无明显变化。UUO组术后第7天肾皮质p27mRNA的表达强， 与SOR组比无统计学意义; 术后第14、 21天后p27mRNA的表达明显降低， 与SOR组比较差异有统计学意义 (P&<0.05); UUO组术后第14天与第21天比较， p27的表达比较无统计学意义(图1)。

　　图1 各组大鼠肾皮质p27mRNA的表达（略）

　　Fig 1 Expression of p27 mRNA

　　1: SOR group; 2: The 7th day after UUO; 3: The 14th day after UUO; 4: The 21st day after UUO; M: DNA marker.

　　2.4 TGFβ的RTPCR结果 SOR组大鼠肾皮质TGFβ mRNA呈低表达; 各时间点UUO组大鼠肾皮质TGFβ mRNA表达明显高于SOR组（P&<0.05）， 尤以梗阻第7 天后增高最为明显， 随着梗阻时间延长， TGFβ逐渐增高（UUO术后第14 天与术后第7 天比， P&<0.05; UUO术后第21 天与术后第7 天比， P&<0.01）， 但UUO组第21 天与第14 天相比， TGFβ mRNA虽有增高， 但无统计学意义(图2)。

　　图2 各组大鼠肾皮质TGFβ mRNA的表达（略）

　　Fig 2 Expression of TGFβ mRNA

　　M: DNA marker; 1: The 7th day after SOR; 2: The 7th day after UUO; 3: The 14th day after SOR; 4: The 14th day after UUO; 5: The 21st day after SOR; 6: The 21st day after UUO.

　　2.5 p27和TGFβ相关分析 对UUO组肾皮质p27 mRNA和TGFβmRNA相关分析采用Spearman相关检验， 显示p27 mRNA和TGFβmRNA成负相关（Rs=-0.788， P&<0.05）。

　　3 讨论
　　
　　肾间质纤维化是由于多种原因引起的细胞外基质合成增加和基质降解减少所致， 其机制非常复杂， 涉及到细胞、 细胞因子和细胞外基质等多种因素。其中， TGFβ在肾间质纤维化等多种器官组织的纤维化疾病中发挥了十分重要的作用， 被公认为纤维化形成与发展的关键性因子。肾间质纤维化最终是肾小管上皮细胞增生肥大和凋亡的结果［1］。在这一过程中， 细胞的增殖/凋亡指数可能是估计肾脏病理预后更为适宜的指标［8］。
　　
　　p27是细胞周期素依赖性激酶（cyclin dependent kinase， CDK）抑制剂， 可广谱抑制多种Cyclin/CDK复合物的活性， 对细胞周期进行调控。正常大鼠肾脏有p27表达， p27对肾脏细胞的增殖、 分化、 凋亡等有重要的调控作用。在新月体肾小球肾炎的组织中， 有新月体细胞大量增殖的部分， 则p27不表达［8］。Brantley等［9］认为p27减少与肾小球系膜细胞增殖和肾小球疾病有关。最近有学者在新生大鼠UUO模型中发现新生大鼠在UUO术后第12天发现p27 mRNA表达下调［10］， 肾小管上皮细胞的过度凋亡促进肾间质纤维化进行性发展。
　　
　　本研究结果显示， p27蛋白在SOR组肾小管上皮细胞的核呈强阳性表达， UUO术后第7天时p27蛋白的表达与SOR 组比较无明显变化; 随着间质纤维化程度的加重， 至第14、 21天时， 肾小管上皮细胞p27蛋白的表达减弱， 明显低于SOR组， 肾皮质p27mRNA水平与p27蛋白质水平变化一致， 进一步证实了UUO术后p27 的动态变化。说明在肾间质纤维化的形成过程中， p27蛋白的减弱与肾小管上皮细胞增殖与凋亡失衡有关， p27参与了UUO大鼠肾间质纤维化的发病过程。
　　
　　在本研究中我们发现TGFβ在UUO术后随着肾间质纤维化程度的加重， 其mRNA水平呈上升趋势， 这结果与文献报道一致［11］。同时结果显示TGFβmRNA与p27mRNA的表达成负相关， 可以推测在UUO大鼠肾间质纤维化模型中， TGFβ的促纤维化作用可能是通过对p27的下调从而使肾小管上皮细胞凋亡数量明显增多， 增殖/凋亡失衡， 肾间质纤维化程度逐渐加重。

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