VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达、 纯化及鉴定

　　　　作者：魏玉英， 宋朝君， 孙元杰， 龚玖瑜， 金伯泉， 杨安钢， 杨 琨

【摘要】 目的: 构建人血管内皮细胞生长因子II型受体（VEGFR2）胞膜外区第三及第四个免疫球蛋白样结构域与GST融合蛋白VEGFR2 D3.4/GST基因的原核表达载体， 在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白。方法: 由公司合成VEGFR2胞膜外区第三、 第四免疫球蛋白样结构域氨基酸的编码序列， 克隆入原核表达载体pGEX4T1中GST标签的下游， 构建重组表达载体pGEX4TVEGFR2D3.4， 将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3) pLysS， IPTG诱导表达VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白， 经不同浓度尿素洗脱纯化后， 表达产物用SDSPAGE和Western blot进行鉴定。结果: SDSPAGE分析表明， 表达产物的相对分子质量（Mr）为46 000， 与理论值相符， 主要以包含体形式存在; 灰度扫描分析融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38.6％， 纯化产物纯度最高为87.1％， Western blot 证实该蛋白为VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白。结论: 利用大肠杆菌表达系统， 获得了较高纯度的包含体形式VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白。

【关键词】 VEGFR2; GST; 融合蛋白; 原核表达; 纯化

　　血管生成是一个严密调控的过程， 其在胚胎发育、 滤泡生长、 伤口愈合及肿瘤的生长转移等病理条件下都起着重要的作用。在几个可能调节血管生成的因子中， 血管内皮细胞生长因子（VEGF）及其受体起着关键的作用。VEGF是一个同源二聚体蛋白， 具有促进血管内皮细胞生成、 有丝分裂及促进血管浸润活性的功能。在胚胎发育过程中， VEGF调节血管的发生及重塑， 而在成人体内， VEGF促进血管的生成［1］。

　　已经确认VEGF（如VEGFA）主要通过两个高亲和力的受体发挥作用: VEGFR1（Flt1) 及VEGFR2 （KDR/Flk1）。VEGFR2是I型跨膜糖蛋白， 胞膜外区有7个免疫球蛋白样结构域， 胞质区有一个激酶结构域， 被一个较大的激酶插入序列分割。 VEGFR2与配体结合后胞质区的激酶结构活化， 可以催化胞质中特定底物酪氨酸残基的磷酸化。VEGF及其受体的生理作用已在基因敲除的实验模型中得到了证实。将编码小鼠VEGF、 Flt1或 Flk1的基因靶向性敲除使得小鼠胚胎内血岛形成减少， 血管发生受损， 内皮细胞发育缺陷， 以致于不能形成正常的血管， 最终导致胚胎死亡。

　　Shinkai等［2］的实验证明， 在VEGFR2的7个胞膜外免疫球蛋白样结构域中， 第三个结构域在最小的配受体结合单位中最重要， 因为只含有前3个结构域或第三、 第四结构域的缺失突变体与VEGF的亲和力较含有7个完整的胞膜外结构域的突变体降为千分之一， 而第三个结构域缺失后将导致配受体结合功能的完全丧失。只含有第二及第三个结构域的突变体亲和力也只有原来的千分之一。通过对配受体结合的动力学分析发现， 第二及第四结构域在维持配受体的高结合力上起主要作用。两个结构域都决定了配体的特异性。此外， 第四个免疫球蛋白样结构域也涉及到受体的二聚体化。缺失该结构域的突变体不能形成紧密联系的二聚体， 因此， 结合到受体上的VEGF很容易脱落下来。

　　鉴于VEGFR2第三及第四免疫球蛋白样结构域的重要作用， 我们在本实验中构建了这部分的原核表达载体， 表达并纯化了目的蛋白， 为制备其单克隆抗体（mAb）、 进一步深入研究其功能奠定了基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 大肠杆菌BL21(DE3) pLysS、 表达载体pGEX4T1为本室保存， 各种限制性内切酶、 T4 DNA 连接酶、 异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）均为TaKaRa公司产品， 质粒提取盒、 胶回收试剂盒均为上海华舜生物工程有限公司产品。小鼠抗GST mAb为本室自行研制。碱基合成由上海海毅生物技术有限公司完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 目的基因的获得及重组表达载体的构建 根据GenBank中人VEGFR2的cDNA基因序列， 委托公司合成第226至403位氨基酸（胞膜外区第三及第四免疫球蛋白样结构域）的编码碱基序列， 并在上下游分别引入EcoR I及Xho I的酶切位点。用这两种限制性内切酶酶切合成的基因片段及pGEX4T1表达载体， 胶回收纯化后， 将目的片段克隆入pGEX4T1中， 转化感受态DH5α细菌， 摇菌培养提取质粒， ， 酶切鉴定并测序正确的重组质粒命名为pGEX4TVEGFR2D3.4。将质粒pGEX4TVEGFR2D3.4转化感受态菌株BL21(DE3) pLysS， 获得pGEX4TVEGFR2D3.4/BL21(DE3) pLysS表达菌种。

　　1.2.2 细菌培养及目的蛋白的诱导表达 将表达菌pGEX4TVEGFR2D3.4/BL21(DE3) pLysS划板培养并挑取单克隆接种于LB培养液中（含100 mg/L氨苄青霉素）， 37℃摇菌过夜， 次日以1∶1 000转接， 振荡培养至A600值达0.6时加入IPTG至终浓度1 mmol/L， 37℃诱导表达过夜， 4℃离心收集细菌备用。

　　1.2.3 包涵体的纯化 (1)超声破碎获得包涵体: 用裂解缓冲液（50 mmol/L TrisHCl， 1 mmol/L EDTA， 100 mmol/L NaCl）重悬收集的细菌沉淀， 溶菌酶冰上作用2 h， 冰浴超声裂菌15 min。将超声破碎后的菌体悬液以5 000 r/min离心5 min。重复上述步骤3、 4次， 至离心后的上清液清亮不黏稠为止。收集上清液， 同时准备不同浓度的尿素洗涤沉淀。(2)洗涤包涵体: 将破碎后离心所得的沉淀依次用不同浓度的尿素洗涤， 2 mol/L、 4 mol/L各洗2遍， 6 mol/L、 8 mol/L各洗1遍， 12 000 r/min离心5 min。取超声裂解上清及不同浓度尿素洗涤、 纯化的上清行SDSPAGE电泳， 分析目的蛋白的表达形式以及融合蛋白纯化的最佳方案。

　　1.2.4 Western blot检测 蛋白纯化产物经SDSPAGE电泳分离后， 将融合蛋白转移至NC膜上， 5 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h， 加入抗GST mAb， 4℃孵育过夜。PBST洗膜4次， 每次10 min， 再加入HRP标记的羊抗小鼠IgG， 37℃温育1 h， PBST和PBS先后洗膜4次后， ECL化学发光显色。

　　2 结果

　　2.1 重组质粒的构建和鉴定 将公司合成的VEGFR2 226403位氨基酸相应编码基因片段送测序， 确认与GenBank中相应区段的碱基无差别后， EcoR I及Xho I双酶切VEGFR2D3.4和pGEX4T1载体， 将目的片段亚克隆入pGEX4T1载体的GST标签下游， 获得重组融合蛋白表达载体pGEX4TVEGFR2D3.4， 以该连接产物转化感受态DH5α大肠杆菌， 挑取单克隆摇菌后提取质粒， 用EcoR I及Xho I双酶切鉴定， 琼脂糖电泳后在相应约540 bp处得到1条DNA片段， 符合预期结果（图1）。

　　图1 重组表达质粒pGEX4TVEGFR2D3.4的酶切鉴定

　　Fig 1 Identification of recombinant plasmids by restrictive enzymes digestion

　　M: DNA marker; 1， 2: The plasmids digested by EcoR I and Xho I.

　　2.2 人VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白的诱导表达 用空载体pGEX4T1和重组载体pGEX4TVEGFR2D3.4分别转化感受态大肠杆菌BL21(DE3) pLysS， 在37℃条件下， 采用IPTG终浓度1 mmol/L诱导表达， 同时设置未诱导组作为对照， 收集不同时相的菌液。SDSPAGE分析显示， pGEX4TVEGFR2D3.4诱导组在约Mr 46 000处出现一条新生蛋白条带， 与预期结果相符合; 而pGEX4T1转化的菌株及未诱导组则无相应的蛋白条带出现， 说明插入的融合基因VEGFR2 D3.4/GST已经成功地在大肠杆菌中表达。灰度扫描分析， 表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的38.6%。

　　2.3 融合蛋白的可溶性分析、 纯化及Western blot 鉴定 经SDSPAGE 电泳分析， 融合蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在， 细菌的裂解上清中（可溶性表达部分）仅存在微量目的蛋白（图3）。

　　采用不同浓度的尿素反复洗涤包涵体的方法对融合蛋白进行纯化， 2、 4 mol/L的尿素各洗2遍， 6、 8 mol/L各洗1遍。取洗脱液行SDSPAGE电泳分析显示， 融合蛋白主要存在于6、 8 mol/L尿素洗脱液中， 纯度分别达87.1%及80.4%。

　　取尿素洗涤纯化液、 转化pGEX4TVEGFR2D3.4的BL21(DE3) pLysS全菌（诱导及未诱导组）以及只含有pGEX4T1空载体的L21(DE3) pLysS菌株进行Western blot 鉴定（图4）。在Mr 46 000处有一条带， 与融合蛋白预期Mr相符， 目的蛋白与抗GST标签抗体有良好的反应性。

　　3 讨论

　　本研究主要涉及VEGFR2胞膜外区第三、 第四免疫球蛋白样结构域的原核表达、 纯化及鉴定。将合成的VEGFR2胞膜外区第三和第四免疫球蛋白样结构域相对应的碱基克隆入pGEX4T1载体中， 再将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS， 经IPTG诱导， 超声裂菌后用不同浓度的尿素洗脱， 最终目的蛋白出现在6 mol/L及8 mol/L 尿素洗脱液中， 纯度分别为87.1%及80.4%。证实了在大肠杆菌表达系统中表达并获得高纯度VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白的可行性， 为制备该结构域的mAb及进一步研究其抗肿瘤活性奠定了基础。

　　血管发生是一个重要的发育过程， 而在一些病理条件下如类风湿性关节炎、 糖尿病性视网膜病变、 实体瘤的生长等过程中也起着至关重要的作用。原发性实体瘤的生长及转移都依赖于新生血管的形成， 如果新生血管形成的过程被阻断， 则肿瘤细胞将发生坏死、 凋亡， 瘤体生长至2～3 mm后就不再继续生长。大量实验证实VEGF及其受体与人类恶性肿瘤的浸润、 转移密切相关。快速生长的肿瘤局部组织常常缺氧， 而在该条件下， VEGF的表达明显上调。VEGF及其受体与多种人类实体瘤的发生有关， 如膀胱癌、 乳腺癌、 结肠癌、 胃肠道肿瘤、 神经胶质瘤、 肾癌、 黑素瘤、 神经母细胞瘤等。将针对内皮细胞上的KDR/Flk1的抗体作为肿瘤疗法有如下优点: 在肿瘤生长部位， KDR/Flk1只选择性的生长在增殖的内皮细胞上， 因此， 针对该受体的抗体是高度特异性的。由于血管内皮细胞直接与血液接触， 与针对肿瘤细胞上特异标记分子的抗体相比， 针对KDR/Flk1的抗体能更好地接近靶分子。此外， 受肿瘤细胞异质性的影响， 针对肿瘤细胞的抗体的效率也受到了很大的限制。相反地， 针对血管内皮细胞上靶分子来破坏肿瘤的血供可以有效地引起肿瘤细胞的死亡。如针对小鼠VEGFR2分子包膜外区（可溶性VEGFR2）的mAb DC101［3］不但可以阻断小鼠来源肿瘤中的血管形成， 在各种人上皮细胞来源的肿瘤模型中， DC101同样能有效的阻断KDR/VEGR的结合， 减少肿瘤组织微血管的密度， 抑制肿瘤生长、 转移。将针对人VEGFR2分子的单链抗体可变区与人IgG1恒定区融合产生的小鼠/人嵌合抗体1C11也可以抑制VEGF诱导的信号转导、 内皮细胞增殖和迁移［4］。

　　研究表明， 与编码VEGFR2包膜外区全长序列的基因疫苗相比， 编码包膜外区14结构域的基因疫苗同样能够降低免疫小鼠血清VEGF的水平， 产生特异性抗体， 激活淋巴细胞， 减少肿瘤转移率、 延长肿瘤潜伏期及荷瘤小鼠的存活时间［5］。因此， 可以推断制备VEGFR2包膜外区某第三、 第四结构域的mAb也将会成为治疗肿瘤的有效手段。

参考文献

［1］ Ferrara N. Vascular endothelial growth factor: molecular and biological aspects［J］. Curr Top Microbiol Immunol， 1999， 237: 1-30.

［2］ Shinkai A， Ito M， Anazawa H， et al. Mapping of the sites involved in ligandassociation and dissociation at the extracellular domain of the kinase insert domaincontaining receptor for vascular endothelial growth factor［J］. J Biol Chem， 1998， 273(47): 31283-31288.

［3］ Vosseler S， Mirancea N， Bohlen P， et al. Angiogenesis inhibition by vascular endothelial growth factor receptor2 blockade reduces stromal matrix metalloproteinase expression， normalizes stromal tissue， and reverts epithelial tumor phenotype in surface heterotransplants［J］. Cancer Res， 2005， 65(4): 1294-1305.

［4］ Li J， Huang S， Armstrong E， et al. Angiogenesis and radiation response modulation after vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR2) blockade［J］. Int J Radiat Oncol Biol Phys， 2005， 62(5):1477-1485.

［5］ Dong J， Yang J， Chen MQ， et al. A comparative study of gene vaccines encoding different extracellular domains of the vascular endothelial growth factor receptor 2 in the mouse model of colon adenocarcinoma CT26［J］. Cancer Biol Ther， 2008， 7(4): 502-509.