PTPN22基因多态性与自身免疫甲状腺病的相关性

【摘要】 目的: 检测PTPN22基因的单核苷酸多态性（SNP）及其与中国人自身免疫甲状腺病（AITD）的相关性， 并研究CTLA4基因SNP与PTPN22 SNP的相互关系。方法: 采用PCRRFLP技术分析231例AITD患者， 其中Graves’病（GD）149例， 桥本甲状腺炎（HT）82例和131例健康对照者PTPN22基因+1858 C&>T及CTLA4基因49A&>G位点的基因型。采用SASPPCR技术分析PTPN22基因启动子-1123G&>C的基因型。结果: （1）PTPN22基因的+1858C&>T位点不存在多态性; （2）PTPN22基因-1123G&>C SNP的等位基因和基因型分布频率在GD组与正常对照组间的差异有统计学意义（P值分别为0.040和0.013， OR值分别为1.44和2.33）; （3） CTLA4基因 49A&>G位点的等位基因和基因型分布频率在AITD组与正常组间有明显差异; （4）与携带PTPN22的G等位基因及CTLA4的AA基因型者相比， 携带PTPN22CC基因型与CTLA4 AG或GG基因型者发生GD的OR值=3.31（95%CI: 2.69-8.89）。结论: PTPN22基因启动子-1123G&>C SNP与GD的发生相关， 其CC基因型与CTLA4基因的G 等位基因对GD的发生起协同作用。

【关键词】 蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22基因 自身免疫性甲状腺病 单核苷酸多态性

　　自身免疫性甲状腺病（autoimmune thyroid disease， AITD）是一组以甲状腺为靶器官的自身免疫性疾病， 包括Graves病（Graves’ disease， GD）、桥本甲状腺炎（Hashimoto’s thyroiditis， HT）及产后甲状腺炎等。遗传因素在AITD的发病中起重要作用， 目前比较肯定的AITD易感基因有人类白细胞抗原基因（human leucocyte antigen， HLA）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytoxic T lymphocytoassociated antigen4， CTLA4）基因。蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22(PTPN22)基因编码淋巴特异性酪氨酸磷酸酶（Lyp）， Lyp是一种细胞内的酪氨酸磷酸酶， 通过其富含脯氨酸的基序（称为P1）与Csk激酶（C末端Src酪氨酸激酶）的SH3结构域相结合， 二者的作用使与T细胞受体（TCR）信号转导有关的激酶如Lck、 Fyn和ZAP70去磷酸化， 发挥抑制T细胞活化的作用［1］。多个大型、 独立的研究重复了PTPN22基因620密码子的1858C/T SNP与1型糖尿病(T1D)［2］、 类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis， RA）［3］、 AITD［4］、 系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus， SLE）［5］等有相关性， 然而对日本人群RA［6］、 T1D［7］以及GD［8］的大样本相关性分析并未发现PTPN22的1858T SNP。为此， 我们选择了与高加索人AITD的发生有相关性的外显子14+1858 SNP以及与日本人T1D的发生相关的启动子-1123 SNP为研究内容， 观察中国北方汉族人群上述位点是否存在多态性以及与AITD的相关性， 并分析CTLA4基因多态性与PTPN22的关系， 探讨AITD的遗传背景。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 病例组为在西安交通大学第一附属医院内分泌专科门诊收集的231例AITD患者， 平均年龄（36.7±14.2）岁， 其中GD 149（男40， 女109）例; HT 82（男21， 女61）例。GD和HT的诊断依据为典型的临床表现结合实验室检查。从我院查体中心按AITD患者的年龄分布、 性别构成随机选取131例健康人为对照， 其中男39例， 女92例， 年龄（34.5±13.3）岁。离心柱型血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒与PCR扩增试剂盒2 Taq PCR Masterix均购自北京天为时代公司; 限制性内切酶Rsa I购自纽英伦生物技术有限公司; Bbv I购自宝生生物工程有限公司。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 外周血基因组DNA的提取 清晨空腹静脉血EDTA抗凝， 采用离心柱型血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取外周血基因组DNA， 按说明书操作。

　　1.2.2 PCR扩增反应 （1）PCR扩增PTPN22基因外显子14: 根据GenBank中的PTPN22基因序列自行设计引物， 上游引物为: 5′TGG GCT CAA GTG ATC CTC TCA3′， 下游引物为: 5′ACT GAT AAT GTT GCT TCA ACG GA3′。反应体系20 μL， 其中2×Taq PCR Masterix 10 μL， 基因组DNA 1 μL， 上下游引物（10 μmol/L）各1 μL。经94℃预变性3 min， 94℃变性30 s， 56℃退火30 s， 72℃延伸30 s， 循环30次后72℃延伸5 min， 150 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。（2） PCR扩增PTPN22启动子: 设计1条共用的上游引物和2条针对3′ 特异性等位基因的下游引物: 上游引物为: 5′ACC CTG CAT ATG TAA TGC TGG T3′， 下游引物1: 5′CAT TGA GAG GTT ATG CAA GCT C3′， 下游引物2: 5′CAT TGA GAG GTT ATG CAA GCT G3′。用2对引物分别扩增同一标本，　　扩增片段长度均为268 bp。反应体系均为20 μL， 其中2×Taq PCR Masterix 10 μL， 基因组DNA 1 μL， 上下游引物（10 μmol/L）各1 μL。引物1退火温度为60℃ 30 s， 引物2退火为62℃ 30 s， 余PCR循环条件同上， 200 g/L的琼脂糖凝胶分析PCR产物。（3）PCR扩增CTLA4的外显子1: 根据文献报道合成引物， 上游引物: 5′GAA GGA TGG TGC TTC ACA GAT3′， 下游引物: 5′CTT TGC AGA AGA CAG GGA TGA3′ ［9］。PCR反应体系为20 μL: 含2×Taq PCR Masterix 10 mL， 上下游引物各1 μL， 基因组DNA 1 μL。退火温度54℃ 30 s， 余PCR循环条件同上， 150 g/L琼脂糖凝胶分析PCR产物。

　　1.2.3 酶切反应 酶切反应体系均为20 μL， PCR扩增产物均为9 μL， 分别用Rsa I (10 U/μL) 0.5 μL酶切PTPN22外显子14， 37℃水浴过夜; Bbv I（3 U/μL） 0.5 μL酶切CTLA4外显子1， 65℃水浴过夜。酶切产物于250 g/L琼脂糖凝胶检测。

　　1.3 统计学处理 读取个体样本， 计算各组基因型频率， 确认其符合HardyWeinberg平衡， 用基因计数法计算各组等位基因频率。采用SPSS11.5软件行统计学处理， 对组间计数资料采用行列表χ2检验， 对不符合四格表χ2检验的数据进行Fisher确切概率法分析。OR值(Odds Ratio， 比值比)用Woolf 法。

　　2 结果

　　2.1 PTPN22基因和CTLA4基因的PCRRFLP分析 PTPN22外显子14 PCR扩增片段长度为506 bp， 经Rsa I酶切可得到3种结果: +1858 SNP为CC基因型时酶切产物为300 bp和206 bp2个片段; TT基因型为506 bp1个片段; CT基因型产生506 bp、 300 bp和206 bp3个片段（图1）。

　　图1 PTPN22基因外显子14酶切产物的琼脂糖凝胶电泳（略）

　　Fig 1 The agarose gel electrohhoresis analysis of digested product in PTPN22 gene exon 14

　　M: DNA marker; 1， 2， 4， 5: CC Genetype; 3: CT genetype.

　　CTLA4外显子1的PCR扩增片段长度为652 bp， 经Bbv I酶切可得到3种结果: 49A/G SNP为基因型AA时产生556 bp和96 bp2个片段; 基因型GG产生480 bp、 76 bp和69 bp3个片段; 基因型AG产生556 bp、 480 bp、 96 bp和76 bp4个片段。由于96 bp及76 bp相对分子质量（Mr）小， 电泳只显示556 bp及480 bp（图2）。

　　图2 CTILA4外显子1酶切产物的琼脂糖凝胶电泳（略）

　　Fig 2 The agarose gel electrohhoresis analysis of digested product in CTILA4 gene exon 1

　　M: DNA marker; 1-3: AG Genetype; 4: Control; 5， 6: GG genetype.

　　2.2 PTPN22基因的SASPPCR分析 PTPN22启动子扩增片段的长度为268 bp， 下游引物1针对等位基因G， 下游引物2 针对等位基因C。-1123SNP为GG基因型时下游引物1可扩增出PCR产物; CC基因型时下游引物2可扩增出PCR产物; GC基因型时2对引物均可扩增出PCR产物（图3）。

　　图3 PTPN22基因启动子扩增产物的琼脂糖凝胶电泳（略）

　　Fig 3 The agarose gel electrohhoresis analysis of PCR product in CTILA4 gene promoter

　　M: DNA marker; a: Primer 1; b: Primer 2; 1， 5: GC genetype; 2， 3: GG genetype; 4: CC genetype.

　　2.3 各组间各位点的等位基因及基因型分布频率比较 PTPN22基因外显子14+1858C&>T位点T等位基因的频率&<1%， 说明该基因座在中国北方汉族人群不具有多态性。PTPN22基因启动子-1123G&>C SNP在各组内男性和女性之间的等位基因及基因型频率分布无明显差异， C等位基因的分布及CC基因型频率在GD组与正常对照组之间有明显差异而在AITD组、 HT组与正常对照组之间的分布无明显不同（表1）。CTLA4外显子1 49A&>G 位点的G等位基因在AITD组、 GD组、 HT组均明显高于正常对照组， 差异有统计学意义; 各病例组与正常对照组基因型分布频率也有显著性差异（表2）。

　　表1 PTPN22基因启动子-1123G&>C的等位基因与基因型分布频率（略）

　　Tab 1 Genotypes and alleles frequency of the-1123G&>C SNP in PTPN22 gene promoter region

　　aP&<0.05 vs normal group.

　　表2 CTLA4基因外显子1 49A&>G的等位基因与基因型分布频率（略）

　　Tab 2 Genotypes and alleles frequency of the 49 A&>G SNP in CTLA4 gene exon 1

　　aP&<0.05 vs normal group; bP&<0.01 vs normal group.

　　2.4 PTPN22和CTLA4基因的相互作用与GD的易感性 PTPN22的CC基因型与CTLA4的AG或GG基因型在增加AITD的易感性方面有协同作用， 与携带PTPN22的G等位基因及CTLA4的AA基因型者相比，携带PTPN22的CC基因型与CTLA4的AG或GG基因型者发生GD的OR值=3.31（表3）。

　　表3 PTPN22基因型和CTLA4基因型相互作用与GD的关系（略）

　　Tab 3 Effect of PTPN22 and CTLA4 genotype on GD

　　3 讨论
　　
　　目前对PTPN22基因与疾病相关SNP的研究主要针对位点+1858 C&>T， 这个位于P1结构域的SNP由编码色氨酸（Trp）的TGG密码子替代了编码精氨酸(Arg)的密码子CGG， 结构上的变异导致了功能缺陷， 免疫沉淀法证实Arg 620可与Csk的SH3结构域结合， 而Trp 620却不能与后者结合， 由此推断Trp 620降低了Lyp下调T细胞活化的作用。在以后的研究中还发现了一种剂量效应关系， 即纯合子个体（1858TT）的Lyp与Csk的结合能力比杂合子个体(1858CT)更低。由此可见PTPN22似乎为TCR信号的转导设置了一个阈值， 当PTPN22与Csk的结合有缺陷时， 对TCR信号转导的抑制作用减弱， T细胞活化的阈值降低， 免疫系统的活性全面增强， 触发了许多潜在的自身免疫反应。但我们的研究未发现+1858T SNP， 这与高加索及北欧等人群中普遍存在此SNP位点且与多种自身免疫病相关的结论不同， 却与先前日本人群的研究结果相似， 说明该基因在亚洲人群中缺少+1858C/T SNP。我们进一步分析了PTPN22启动子-1123G&>C位点， 结果提示此位点的SNP与GD的发生相关， 说明除+1858C&>T 外， PTPN22基因上存在与AITD相关的其他SNPs。文献报道在高加索人， -1123G&>C与+1858C&>T两多态性位点之间存在连锁不平衡（D’=0.99， r2=0.57， χ2=378.8， P=8.5×10-82）， 由此作者推断-1123G&>C与自身免疫病的相关性可能是通过与+1858C&>T连锁不平衡而发挥作用的［7］。我们的研究中未发现这种连锁不平衡， 至于-1123G&>C SNP， 目前还不十分明确其对Lyp表达的影响。有人研究此位点周围的DNA序列， 发现-1123G与转录因子激活蛋白4(AP4)的结合位点相匹配， 后者属螺旋环螺旋拉链结构家族， 结合转录因子反义链。-1123G&>C位于AP4结合序列的中心基序区域(-1130gcaaGCTGaa-1121)［10］， 而-1123C等位基因不能与任何已知的转录因子的结合元素相匹配。因此， PTPN22的-1123C可能影响了Lyp的转录效率， 我们推测这可能是-1123G&>C多态性与GD呈相关性的原因。
　　
　　AITD是一种多基因遗传性疾病， 基因之间的相互作用可能影响疾病的发生。我们的研究提示CTLA4基因是AITD的易感基因， 其与PTPN22基因SNP的分布之间无关联， 但两基因均为突变型时增加了GD发生的机会。即说明两基因的变异对疾病的发生起协同作用， 虽然我们的研究不能对这一协同作用的病理生理基础做出解释。
　　
　　总之， +1858C&>T SNP具有种族特异性， 它并不是PTPN22基因上与AITD相关的惟一位点， 我们的研究初步证实该基因启动子的-1123G&>C SNP与中国北方汉族人群GD的发生有相关性， PTPN22基因上是否有其他未知的变异或单倍体与AITD相关， 有待于更深入的研究。

参考文献

　　［1］ Mustelin T， Alonso A， Bottini N， et al. Protein tyrosine phosphatases in T cell physiology［J］. Mol Immunol， 2004， 41(6-7): 687-700.

　　［2］ Chelala C， Duchatelet S， Joffret ML， et al. PTPN22 R620W functional variant in type 1 diabetes and autoimmunity related traits［J］. Diabetes， 2007， 56(2): 522-556.

　　［3］ Wesoly J， Hu X， Thabet MM， et al. The 620W allele is the PTPN22 genetic variant conferring susceptibility to RA in a Dutch population［J］. Rheumatology(Oxford)， 2007， 46(4): 617-621.

　　［4］ Heward JM， Brand OJ， Barrett JC， et al. Association of PTPN22 haplotypes with Graves’ disease［J］. J Clin Endocrinol Metat， 2007， 92(2): 685-690.

　　［5］ Kyogoku C， Langefeld CD， Ortmann WA， et al. Genetic assoCIation of the R620W polymorphism of protein tyrosine phosphatase PTPN22 with human SLE［J］. Am J Hum Genet， 2004， 75(3): 504-507.

　　［6］ Ikari K， Momohara S， Inoue E， et al. Haplotype analysis revealed no assoCIation between the PTPN22 gene and RA in a Japanese population［J］. Rheumatology (Oxford)， 2006， 45(11): 1345-1348.

　　［7］ Kawasaki E， Awata T， Ikegami H， et al. Systematic search for single nucleotide polymorphisms in a lymphoid tyrosine phosphatase gene (PTPN22): assoCIation between a promoter polymorphism and type 1 diabetes in Asian populations［J］. Am J Med Genet A， 2007， 143(15): 1812-1813.

　　［8］ Ban Y， Tozaki T， Taniyama M， et al. The codon 620 single nucleotide polymorphism of the protein tyrosine phosphatase22 gene does not contribute to autoimmune thyroid disease susceptibility in the Japanese［J］. Thyroid， 2005， 15(10): 1115-1118.

　　［9］ 王巧宏， 任跃忠. 中国人CTLA4基因外显子1多态性与Graves病的相关性［J］. 中华内分泌代谢杂志， 2003， 19(4): 297-299.

　　［10］ Juliger S， Bongartz M， Luty AJ， et al. Functional analysis of a promoter variant of the gene encoding the interferongamma receptor chain I［J］. Immunogenetics， 2003， 54(10): 675-680.