HMGB1对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬和IA/E表达的影响

【摘要】 目的: 探讨HMGB1对巨噬细胞免疫功能的影响。方法: 梯度浓度HMGB1处理小鼠腹腔巨噬细胞， 或将小鼠随机分为生理盐水对照、 24 h和48 h高与低剂量HMGB1注射组， 腹腔注射0.2 μg或20 μg HMGB1， 或生理盐水。检测巨噬细胞吞噬功能和IA/E表达。结果: 10 μg/L HMGB1刺激6～12 h， 巨噬细胞吞噬功能较其他剂量组明显增强(P&<0.05或P&<0.01)。HMGB1对培养巨噬细胞IA/E表达无影响。高剂量HMGB1攻击小鼠24 h， 其腹腔巨噬细胞吞噬能力明显降低（P&<0.05）; 低剂量HMGB1攻击48 h， 巨噬细胞IA/E表达明显上调（P&<0.05或P&<0.01）。结论: 高剂量HMGB1抑制巨噬细胞吞噬功能， 低剂量HMGB1增强巨噬细胞免疫功能。

【关键词】 高迁移率族蛋白B1 巨噬细胞 吞噬 IA抗原 IE抗原

　　新近研究发现，核内蛋白高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein， HMGB1）可由死亡细胞或活化单核/巨噬细胞释放至胞外， 发挥广泛促炎效应［1， 2］。因较TNFα、 IL1β等分泌延迟、 持续时间久，国内外学者将HMGB1称作“晚期”炎症介质［1， 3］。若拮抗HMGB1， 则脓毒症动物脏器功能改善， 生存率增加［4］。HMGB1能否影响单核/巨噬细胞其他功能， 如免疫防御、 免疫监视、 抗原提呈及免疫调节等， 其影响的程度及范围如何？ 这些问题尚待阐明。鉴于此， 我们将探讨HMGB1对体内外巨噬细胞吞噬和抗原提呈功能影响，为脓毒症HMGB1拮抗治疗方案提供免疫学证据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 DMEM(Hyclone)、 胎牛血清(特优级， Hyclone)、 多黏菌素B(Sigma)、 HMGB1(Sigma)、 0.72 g/L中性红溶液、 Hanks液、 细胞消化液(无钙镁Hanks液+2.5 g/L胰酶+0.2 g/L EDTA)、 细胞裂解液(冰醋酸与无水乙醇1∶1混合)。RPE标记抗IA/E及RPE标记同型对照、 FITC标记抗CD14、 抗FcγⅡ/Ⅲ受体抗体、 染色缓冲液， 购自BD/PharMingen公司。流式细胞分析仪（FACS/Calibur）为BectonDickinson产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 腹腔巨噬细胞的分离、 纯化 常规方法， 用DMEM (100 mL/L FCS)调整腹腔巨噬细胞密度为3×109/L， 备用。

　　1.2.2 体外试验分组 3×109/L巨噬细胞入96孔培养板， 0.1 mL/孔， 孵育2 h， 去未贴壁细胞， 加DMEM(100 mL/L FCS) 0.1 mL/孔， 多黏菌素B (7×106 U/L) 1 μL/孔， 以中和可能沾染内毒素。台盼蓝染色证实细胞活率&>95%， 瑞氏染色证实巨噬细胞纯度&>85%。再分为培养体系内HMGB1终浓度为0、 1、 10、 100、 1000、 5000 μg/L6个组， 每浓度3个平行孔， 分为0、 3、 6、 12、 24 h时相， 分别在培养终点前24、 18、 12、 0 h加入相应浓度HMGB1。重复试验3～4次。

　　1.2.3 体内试验分组 6周龄SPF级雄性BALB/c小鼠，随机分为生理盐水对照(NS)、 24 h高和低剂量HMGB1注射组［24 h(H)或24 h(L)］、 48 h高和低剂量HMGB1注射组［48 h(H)或48 h(L)］， 每组每个时相点4只。动物禁食过夜， 晨8∶00腹腔注射0.2 mg/L或20 mg/L HMGB1， 或生理盐水， 0.5 mL/只， 于20∶00再次腹腔注射0.2 mg/L或20 mg/L HMGB1， 或生理盐水， 0.5 mL/只。于相应时相点， 收集、 分离、 纯化腹腔巨噬细胞， 方法同前， DMEM培养液(100 mL/L FCS)调整至3×109/L， 部分用于检测巨噬细胞吞噬功能， 部分用于检测巨噬细胞IA/E表达。

　　1.2.4 指标检测 (1)巨噬细胞吞噬功能: 用DMEM培养液(100 mL/L FCS)调整收集的巨噬细胞至3×109/L， 0.1 mL/孔， 孵育4 h， 弃上清， 加0.72 g/L中性红溶液0.1 mL/孔， 继续孵育30 min， 弃中性红， 0.01 mol/L PBS洗4遍， 加细胞裂解液0.2 mL/孔， 37℃过夜。检测A540值。A540值大小用于反映巨噬细胞的吞噬能力强弱。(2)巨噬细胞IA/E表达: 收集培养或体内试验分离的腹腔巨噬细胞0.5×106～1.0×106， 经抗FcγⅡ/Ⅲ受体抗体1 μg处理。再加入FITC标记抗CD14及RPE标记抗IA/E或RPE标记同型对照， 4℃避光孵育30 min， 洗涤后10 g/L多聚甲醛重悬， 固定。采用流式细胞仪配套的CellQuest软件进行分析检测， 其中FITC、 RPE分别设在FL1、 FL2荧光通道上， 在CD14/SSC上根据CD14+设门， 每次获取门内10000个细胞。阴性对照为未染色全阴性对照和RPE标记同型对照。

　　1.2.5 统计学分析 在统计软件Stata 7.0上运行， 体外试验结果采用两因素方差分析和单因素方差分析及组间比较分析， 体内试验结果采用单因素方差分析和t检验。

　　2 结果

　　2.1 HMGB1对培养腹腔巨噬细胞吞噬功能影响 HMGB1刺激后6 h， 10 μg/L浓度组较其他组吞噬中性红量明显增加（P&<0.05或P&<0.01）; HMGB1刺激后12 h， 1和10 μg/L浓度组较其他组吞噬中性红量明显增加（P &<0.05或P&<0.01）， 且尤以10 μg/L浓度组最为明显(图1)。

　　图1 HMGB1刺激后巨噬细胞吞噬功能变化（略）

　　Fig 1ChangesinphagocytosisofmacrophagesstimulatedwithHMGB1

　　2.2 HMGB1对培养腹腔巨噬细胞IA/E表达影响 HMGB1浓度对腹腔巨噬细胞IA/E表达无影响， 培养时间对巨噬细胞IA/E表达影响明显(F=24.15， P=0.0000)。巨噬细胞IA/E阳性表达率由初始的(53.68±14.88)％， 培养12 h增强为64.58％～68.18％， 培养24 h减弱至34.12％～37.42％。

　　2.3 HMGB1对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能影响 HMGB1攻击后， 巨噬细胞吞噬中性红量减少幅度达43%～67%。与NS对照组相比， 高剂量攻击24 h明显降低巨噬细胞吞噬能力（t=2.7274， P=0.017）， 其他组间差异无统计学意义（表1）。

　　2.4 HMGB1对小鼠腹腔巨噬细胞IA/E表达影响 无论高剂量还是低剂量HMGB1攻击24 h， 巨噬细胞IA/E表达量无明显变化。低剂量HMGB1攻击48 h， 巨噬细胞IA/E表达较生理盐水对照组、 低剂量24 h时相组和高剂量48 h时相组明显上调（P&<0.05或P&<0.01， 表1、 图2）。

　　表1 HMGB1攻击后小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能和IA/E表达情况（略）

　　Tab 1 Changes in phagocytosis and IA/E expression of peritoneal macrophages challenged with HMGB1 in mice

　　aP&<0.05，bP&<0.01vsNS; dP&<0.01vs24h(L); eP&<0.05 vs 48 h(H).

　　图2 HMGB1攻击后小鼠腹腔巨噬细胞IA/E表达情况（略）

　　Fig 2 IA/E positiveexpression rate of peritoneal macrophages among groups

　　3 讨论
　　
　　单核巨噬细胞作为机体第1道防线， 将抗原吞噬、 加工提呈给免疫活性细胞， 才能激发各类免疫应答反应。而巨噬细胞能否提呈抗原以及提呈抗原作用的强弱与Ia抗原表达直接相关。研究结果显示， HMGB1处理巨噬细胞6～12 h， 10 μg/L浓度可明显增强其吞噬功能。依据体外试验结果， 设计体内试验， 分为高剂量组（20 μg/只， 相当于1000 ng/g体质量）和低剂量组（0.2 μg/只， 相当于10 ng/g体质量）， 以生理盐水为对照。因缺少HMGB1体内半衰期数据资料， 依据其他细胞因子体内降解规律， 我们将HMGB1分2次注射， 时间间隔12 h。结果显示， 无论高剂量， 还是低剂量HMGB1攻击小鼠， 巨噬细胞吞噬能力均减弱， 但高剂量HMGB1攻击24 h， 巨噬细胞吞噬功能极度抑制。
　　
　　事实上， 胞外分泌的HMGB1到底是“敌”还是“友”存在争议［5］。因细胞坏死后向细胞外释放大量HMGB1可能介入抗原提呈细胞活化， 有学者提出HMGB1可能为内源性免疫调节因子， 并进而影响免疫反应启动和激烈程度［6］。在体外， 应用HMGB1或其组分抗体均能降低坏死细胞引起的树突状细胞活化， 同时， HMGB1基因敲除细胞培养上清液不能活化树突状细胞; 在体内， 无论坏死细胞来源还是人工合成HMGB1均能增加针对外源可溶性抗原IgG产生， 并介导低分化淋巴瘤持久免疫［7］。我们体内试验结果还提示， HMGB1攻击24 h， 巨噬细胞IA/IE表达不受剂量影响， 但HMGB1攻击48 h， 低剂量组巨噬细胞IA/E表达率显著上调。MHCⅡ类分子表达既受分化调节， 也受外来免疫和炎性刺激调节。研究表明， HMGB1与IL2、 IL1、 IL12联合能刺激巨噬/单核细胞促进NK细胞IFNγ产生［8］， HMGB1与树突状细胞共培养， 观察到树突状细胞MHC II分子表达上调， 说明HMGB1可促进树突状细胞成熟分化， 诱导T细胞向Th1分化的细胞因子IL12、 IL2和IFNγ分泌增加［9］。我们试验结果也提示低剂量HMGB1攻击后， 小鼠血浆IL2增加（结果未发表）， 此可能与低剂量HMGB1有助于小鼠巨噬细胞IA/E表达增强有关。
　　
　　总之， 大剂量HMGB1抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬， 下调巨噬细胞MHCⅡ类分子表达， 将减弱巨噬细胞抗原提呈功能， 而适度HMGB1负载可能对机体免疫防御有益。然而， 病理状态下HMGB1的动态变化特征与机体免疫系统机能间关系如何？ 相关的作用机制是什么？ 仍待探讨。

参考文献

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　　［2］ Scaffidi P， Misteli T， Bianchi ME. Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation［J］. Nature， 2002， 418(6894): 191-195.

　　［3］ Wang H， Yang H， Tracey KJ. Extracellular role of HMGB1 in inflammation and sepsis［J］. J Intern Med， 2004， 255(3): 320-331.

　　［4］ Yang H， Ochani M， Li J， et al. Reversing established sepsis with antagonists of endogenous highmobility group box 1［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2004， 101(1): 296-301.

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　　［8］ DeMarco RA， Fink MP， Lotze MT. Monocytes promote natural killer cell interferon gamma production in response to the endogenous danger signal HMGB1［J］. Mol Immunol， 2005， 42(4): 433-444.

　　［9］ Messmer D， Yang H， Telusma G， et al. High mobility group box protein 1: an endogenous signal for dendritic cell maturation and Th1 polarization［J］. J Immunol， 2004， 173(1): 307-313.