人TLR2胞外区基因的原核表达及其抗体的制备

　　　　 作者：孙守勋， 李强， 刘静， 李玲， 蒲晓允

【摘要】 目的: 在原核系统中表达人Toll样受体2（TLR2）胞外区基因的融合蛋白并制备多克隆抗体。方法: 应用RTPCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2胞外区基因， 将其克隆到表达载体pET32a(+)上构建重组原核表达质粒， 并在大肠杆菌中诱导表达， 目的融合蛋白经NiNTA亲和层析纯化， 用SDSPAGE和 Western blot进行鉴定。用纯化的蛋白免疫新西兰白兔， 制备多克隆抗体， 采用Western blot对抗体进行鉴定， 并用ELISA分析抗体活性。结果: 成功构建了pET32a(+)TLR2重组表达质粒并在大肠杆菌中进行表达， 获得了纯化重组蛋白， 重组蛋白免疫白兔后能够有效地刺激抗体产生， 并具有良好的免疫活性。结论: 成功地获得人TLR2胞外区基因的融合蛋白， 制备的多克隆抗体为进一步研究TLR2胞外区的功能和生物活性奠定基础。

【关键词】 TLR2; 原核表达; 多克隆抗体; 单个核细胞

　　Toll样受体作为细胞表面的模式识别受体， 能够对病原体识别、 结合、 引发一系列信号间的转导， 促进各种炎性介质的释放， 对宿主的天然免疫防御具有重要作用， 目前其家族成员至少有11个［1］。TLR与天然免疫应答关系的研究中， 倍受关注的是TLR2和TLR4。其中TLR2识别的配体最多， 可协助TLR4参与人体内对LPS的反应。在TLR2的结构中其胞外区富含亮氨酸的重复序列， 是配体作用的关键功能区域。我们应用RTPCR方法从人外周血单个核细胞中克隆TLR2胞外区基因， 并利用原核表达体系表达该基因的融合蛋白， 制备多克隆抗体并检测其活性， 为进一步研究TLR2胞外区的功能奠定必要的基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 淋巴细胞分离液购自天津TBD公司， Tripure购自Roche公司;　　AMV反转录酶、 Taq酶、 T4 DNA连接酶、 限制性内切酶EcoR I和Sal I均为TaKaRa公司产品; 胶回收试剂盒、 质粒提取试剂盒购自博大泰克公司; LPS、 IPTG、 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂为Sigma公司产品; 羊抗兔IgG抗体购自北京中山公司， 原核表达载体pET32a(+)， 抗His抗体和NiNTA亲和纯化试剂盒购自Novagen公司， 大肠杆菌DH5α、 BL21(DE3)由本院中心实验室保存。其余试剂为进口及国产分析纯， 实验用仪器和动物为本院和学校中心实验室及实验动物中心提供。引物合成及DNA测序由上海英骏生物公司完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 人外周血单个核细胞的分离与培养 在本院检验科门诊收集体检患者的静脉血（EDTA抗凝）， 其各项血液指标均正常， 按操作说明用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞， PBS洗涤后培养于RPMI1640培养液中(含100 mL/L胎牛血清， 脂多糖溶液10 g/L， 青霉素10 万U/L)。细胞经脂多糖刺激培养后， 提取RNA。

　　1.2.2 总RNA的提取 以Tripure分离试剂提取细胞总RNA， 具体步骤按德国Roche公司的Tripure Isolation Reagent操作说明进行。总RNA-70℃保存。

　　1.2.3 逆转录聚合酶链反应（RTPCR）扩增目的片段 由GenBank下载人TLR2全序列， 并根据原核表达载体pET32a(+)上的多克隆位点采用Primer Premier5.0设计一对TLR2胞外区扩增引物。上游引物为5′GCCGAATTCATGCCACATACTTTGTGGATGGT3′; 下游引物为5′CGGGTCGACTCACATTAAGGGTACAGTCATCAG3′。其中上游引物的5′端引入EcoR I的酶切位点（下划线表示）， 下游引物的5′端引入Sal I的酶切位点（下划线表示）， 内含启动子ATG和终止密码子TCA。以提取的细胞总RNA为模板， 按常规方法建立逆转录反应体系及条件合成cDNA。采用降落PCR(Touchdown PCR， TDPCR )的方法设置反应条件， 按引物的最小Tm值减5度设定温度梯度。反应条件为: 先在94℃变性3 min后， 94℃， 30 s; 62℃， 1 min; 72℃， 1 min; 10个循环， 94℃， 30 s; 60℃， 1 min; 72℃， 1 min; 10个循环， 94℃， 30 s; 57℃， 1 min; 72℃， 1 min; 10个循环， 94℃， 30 s; 55℃， 1 min; 72℃， 1 min; 12个循环， 最后72℃延伸10 min。10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物， 切胶纯化回收目的片段。

　　1.2.4 重组原核表达载体的构建与鉴定 用EcoR I和Sal I分别双酶切纯化回收的目的基因片段和pET32a(+)表达质粒， 经琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收后， 用T4DNA连接酶16℃过夜连接载体和目的片段， 得到重组表达载体pET32a(+)TLR2。重组质粒转化感受态表达菌株BL21(DE3)， 涂布Amp+的LB平板培养过夜， 挑选阳性菌落， 扩增后提取质粒， 双酶切鉴定， 对鉴定正确的质粒将其菌液送公司测序。

　　1.2.5 重组融合蛋白的诱导表达 将阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)， 挑取单克隆接种于Amp+的LB液体培养基中， 37℃过夜培养。次日， 按1∶100的比例接种， 220 r/min， 37℃进一步扩大培养至细菌密度为A600=0.6时， 加入异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1 mmoL/L进行诱导， 25℃继续培养4 h， 同时设含有空载体质粒和未诱导的菌液为阴性对照。离心收集诱导菌， 于2×SDS上样缓冲液中重悬细菌， 100℃煮沸10 min， 12 000 r/min离心5 min， 取上清进行SDSPAGE分析， 具体电泳方法参见文献［2］进行。

　　1.2.6 重组蛋白的纯化及鉴定 挑取单克隆菌落接种于30 mL的Amp+的LB液体培养基中， 摇床中37℃过夜培养， 按前述同样的方法诱导重组蛋白的表达并收集菌液， 4℃、 5 000 g离心15 min， 弃上清后用预冷的PBS洗涤2次， 加入溶菌酶至终浓度10 mg/L， 室温消化后置冰浴中超声破碎细菌， 将经过超声裂解处理后的细菌裂解液用NiNTA亲和纯化试剂盒纯化回收目的蛋白， 具体操作按Novagen公司产品说明书进行。收集过柱洗脱液， 用SDSPAGE检查纯化效果， Western blot检测目的融合蛋白。

　　1.2.7 抗血清的制备 用纯化的TLR2融合蛋白以500 μg/(只·次)免疫新西兰白兔， 初次免疫与福氏完全佐剂混合乳化后， 于背部皮下多点注射。以后每隔10 d加入等量的福氏不完全佐剂加强免疫共3次， 于第4次免疫1周后采血， 分离血清， 得到的多克隆抗体于4℃保存。

　　1.2.8 抗体的效价及特异性检测 将纯化的融合蛋白以10 mg/L的浓度包被至酶标板， 每孔50 μL， 待测抗血清倍比稀释后， 采用ELISA方法检测， 酶标仪测定A495的吸光度值为指标， 检测抗体效价。以纯化的蛋白为抗原， 制备的血清为一抗（1∶2 000稀释）， HRP标记的羊抗兔IgG为二抗（1∶2 000稀释）， 按常规方法利用Western blot检测抗体的特异性。

　　2 结果

　　2.1 人外周血单个核细胞总RNA的提取 提取出的总RNA经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定， 可以看到两条清晰的条带， 分别为28 S和18 S， 且约为2∶1， 表明获得较好的总RNA（图1）。

　　图1 人外周血单个核细胞总RNA的电泳图谱

　　2.2 TLR2胞外区目的基因的扩增 通过从人外周血单个核细胞中提取总RNA， 应用RTPCR技术， 利用特异性引物扩增目的基因。经10 g/L琼脂糖凝胶电泳显示， 扩增产物大小约为1 000 bp左右， 同预期目的片段的大小符合（图2）。

　　2.3 重组表达载体的构建与鉴定 PCR的扩增产物经切胶回收纯化后， 用EcoR I和Sal I双酶切并连接到经相同酶切的pET32a(+)表达载体中， 双酶切鉴定， 结果表明TLR2胞外区目的基因已经正确克隆到原核表达载体pET32a(+)中， 阳性克隆送交公司测序证实插入序列和读码框架正确， 表明重组表达载体pET32a(+)TLR2构建成功（图3）。

　　2.4 融合蛋白的诱导表达及纯化 将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中， 经过IPTG诱导， 超声破菌后在上清中可获得目的蛋白的可溶性表达， 离心后收集的上清经NiNTA亲和层析纯化， 获得Mr约为38 000的蛋白带， 与预期的理论值相符（图4）。

　　2.5 Western blot对目的融合蛋白的检测 将诱导表达后的菌体蛋白经NiNTA亲和层析纯化后进行SDSPAGE， 然后转移至硝酸纤维素膜上， 进行Western blot分析。结果显示目的融合蛋白可以和抗组氨酸的特异性单抗反应， 呈现一条特异性的反应条带（图5）。

　　2.6 多克隆抗体的鉴定 抗TLR2多克隆抗体只与目的Mr的蛋白发生反应， 呈现单一条带， 而空白菌蛋白的对照组无任何条带出现， 表明所制备的抗体具有较好的特异性（图6）。ELISA测定效价结果显示， 当抗血清稀释至1∶3 200时仍呈现阳性反应。

　　3 讨论

　　TLR2作为Toll样受体家族中的重要成员， 其在免疫应答各个环节中的功能和作用日渐引起研究者的广泛关注。已知TLR2主要表达于单核细胞、 巨噬细胞、 树突状细胞、 部分T淋巴细胞和外周血白细胞［3］ 。TLR2可以识别多种病原体相关分子模式(pathogen associated molecular paterns， PAMPs)， 具有广泛的配体识别谱。近年研究发现， TLR2在识别B族链球菌引发宿主防御反应中发挥重要作用， 其生成产物使细胞壁的超微结构发生变化［4］， 并且能够诱导TLR2依赖的抗菌基因活化［5］。在TLR2识别各种配体的过程中， TLR1和TLR6扮演着重要角色， 它们与TLR2结合形成异物二聚体才能使TLR2诱导免疫应答， 分泌各种细胞因子， 发挥抗感染的作用。最近， Vanhoutte等［6］的研究发现， TLR2也能和TLR3结合共同作用而增强免疫应答反应。另外， TLR2在物理、 化学及缺血等非感染因素所导致的组织损伤以及组织修复的过程中也发挥重要作用。最近研究又发现TLR2参与β细胞的调亡并且诱导自身免疫性糖尿病的发生［7］， Tunheim等［8］又证明了TLR2能够有希望成为一种新型的重组免疫球蛋白疫苗用于预防和治疗一些自身免疫性疾病， 关于TLR2基因的多态性， 特别是TLR2基因多态性与感染性疾病和肿瘤易感性之间的关系更是深入研究的热点。可见TLR2在免疫应答反应中的重要性， 对其在各个方面的研究还有许多尚待阐明的问题， 而TLR2的胞外段作为其重要的功能区域， 更是值得在不同层次上加以深入研究。

　　在本试验中我们所使用的pET32a(+)是一种融合表达质粒， 其主要特点是除能够编码6个组氨酸残基外， 还带有大肠杆菌的TrxA基因， 它能够编码硫氧还原蛋白与外源蛋白融合表达， 提高表达产物的稳定性和可溶性。同时利用重组蛋白上的组氨酸标签可以和NiNTA琼脂糖树脂中的Ni2+结合的原理对融合蛋白进行纯化， 通过 Western blot利用抗组氨酸的特异性单抗对表达的目的蛋白进行初步鉴定， 实验结果显示TLR2胞外区的融合蛋白大小与预测值基本一致。已知多克隆抗体具有制备周期短， 血清滴度较高等优点而受到广泛的应用。在本实验中我们利用原核表达体系成功表达了TLR2胞外区融合蛋白， 并制备了多克隆抗体， 经鉴定抗体具有良好的特异性， 为进一步研究TLR2胞外区的结构和功能， 生物活性及信号传导途径奠定必要的基础。

参考文献

［1］ Vives PM， Somoza N， Femandez Alvarez J， et al. Evidence of expression of endotoxin receptors CD14， Tolllike receptors TLR4 and TLR2 and associated molecule MD2 and of sensitivity to endofoxin (LPS) in islet beta cells［J］. Clin Exp Immunol， 2003， 133 (2): 208-218.

［2］ 奥斯伯FM， 布伦特R， 史密斯JA， 等著(马学军， 舒跃龙， 颜子颖， 等译). 精编分子生物学实验指南［M］. 4版. 北京: 科学出版社， 2005: 386-390.

［3］ 刘艳君， 富 宁. 广谱模式识别分子Tolllike receptor 2 的研究进展［J］. 免疫学杂志， 2002， 18(3): 234-236.

［4］ Asplin IR， Carl DJ， Way SS， et al. Role of Tolllike receptor 2 in innate resistance to Group B Streptococcus［J］. Microb Pathog， 2008， 44(56): 43-51.

［5］ Draper DW， Bethea HN， He Y. Tolllike receptor 2dependent andindependent activation of macrophages by group B streptococci ［J］. Immunol Letter， 2006， 102(26): 202-214.

［6］ Vanhoutte F， Paget C， Breuilh L， et al. Tolllike receptor (TLR)2 and TLR3 synergy and crossinhibition in murine myeloid dendritic cells［J］. Immunol Letter， 2008， 35(9): 80-88.

［7］ Kim HS， Han MS， Chung KW， et al. Tolllike receptor 2 senses βcell death and contributes to the initiation of autoimmune diabetes［J］. Immunity， 2007， 27(8): 321-333.

［8］ Tunheim G， Keith M， Agnete B， et al. Human receptors of innate immunity(CD14， TLR2) are promising targets for novel recombinant immunoglobulinbased vaccine candidates［J］. Vaccine， 2007， 25(40): 4723-4734.