大鼠透明质酸合成酶3基因真核表达载体的构建及趋化作用研究

【摘要】 目的: 构建透明质酸合成酶3（hyaluronan synthase3）真核表达载体， 转染真核细胞并检测重组蛋白酶活性。方法: 提取损伤大鼠坐骨神经总RNA， RTPCR扩增HAS3编码框cDNA， 构建于真核表达载体pcDNA3.1D中， 并亚克隆到荧光载体pEGFPN1中。将构建好的质粒转染大鼠施旺细胞RSC96， 检测HAS3的表达及酶活性。研究转染细胞培养上清对巨噬细胞的趋化作用。结果: HAS3真核表达载体pcDNA3.1DHAS3及pEGFPHAS3测序结果显示片段插入正确， 序列与GenBank公布数据一致， 转染RSC96细胞并检测到重组蛋白的表达和酶活性， 过表达HAS3细胞的培养上清对巨噬细胞的趋化作用显著高于未转染细胞上清。结论: 成功地构建HAS3真核表达载体且真核表达的重组HAS3具有合成HA活性， HAS3过表达培养上清能趋化巨噬细胞， 在体内可能参与到炎症反应中。

【关键词】 透明质酸合成酶 载体构建 真核表达 趋化

　　透明质酸（hyaluronic acid， HA）是由葡萄糖醛酸及乙酰氨基葡萄糖二糖单位重复排列构成的不典型的氨基聚糖， 广泛的分布于各种结缔组织、 皮肤、 软骨、 滑液中。研究证明HA在体内不仅仅是作为细胞外基质参与到组织的结构组成上， 它还是一个重要的细胞外信号分子， 在细胞迁移、 肿瘤、 创伤修复等方面起重要作用。HA在体内由透明质酸合成酶（HAS）合成。Itano等［1］于1996年从1株突变的小鼠乳腺癌细胞中第1次克隆出哺乳动物HAS， 并被命名为mmHAS1。Spicer等［2］随后从小鼠胚胎中克隆出第2个家族成员mmHAS2。1年后该实验室又成功克隆出HAS家族第3个成员HAS3［3］。目前普遍认为， HAS1与HAS2催化合成大的相对分子质量（Mr）HA（HMWHA）， 其中HAS1在整个生命过程中都有表达， 但催化效率不高; HAS2在胚胎发育时表达显著。HAS3合成小Mr HA（LMWHA）， 是在成年体内最为活跃， 参与了多种生理、 病理过程。为研究HAS3及LMWHA的功能及其作用机制， 我们构建了大鼠HAS3真核表达载体， 通过真核表达中检测酶活性， 并进一步发现其对巨噬细胞有趋化作用， 为深入研究打下了基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 SD大鼠（雄性， 180～200 g）购自广州中医药大学实验动物中心; RSC96细胞来源于ATCC， 购自中国科学院上海细胞库; TOP10菌种、 pcDNA3.1D、 pEGFPN1质粒为本实验室保存; 各种内切酶及T4连接酶购自TaKaRa公司; KOD Plus 高保真酶、 ReverTra Ace逆转录试剂盒购自ToYoBo公司; TRIzol、 Lipofectamine2000购自Invitrogen公司; DMEM、 胎牛血清购自 Gibco公司; 质粒回收及DNA纯化试剂盒购自OMEGA公司; DNA合成及测序由英骏广州公司完成。其他化学试剂均为分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠HAS3全长cDNA的克隆及载体构建 根据GenBank公布的大鼠HAS3 mRNA序列， 通过序列中本身含有的KpnⅠ酶切位点将全长ORF分5′端和3′端两段进行扩增， 参照pcDNA3.1D多克隆位点的酶切位点， 共设计两对扩增引物。5′端扩增上游引物为5′GTCAAGCTTCACCATGCCGGTGCAGCTGACTAC3′， 含有Hind Ⅲ酶切位点， 下游引物为5′CTTCTGATGGTACCAGTCCTC3′， 含有KpnⅠ酶切位点。3′端扩增上游引物为5′GGAGGACTGGTACCATCAGAAG3′， 含有KpnⅠ酶切位点， 下游引物为5′GTCCTCGAGACCTCAGCAAAAGCCAGGC3′， 含有XhoⅠ酶切位点。用TRIzol提取CCI大鼠损伤神经总RNA， 逆转录合成cDNA第1链， 用作PCR的模板。首先用3′端片段的引物扩增， Tm=60℃， 共进行35个循环， 切胶回收。用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切PCR产物和pcDNA3.1D质粒4 h， 回收酶切产物， 将PCR酶切产物和酶切质粒按照10∶1混合， 16℃连接过夜， 转化TOP10大肠杆菌， 菌落PCR鉴定阳性克隆， 提取重组质粒pcDNA3.1DHAS3f3， 酶切鉴定， 测序。用同样方法扩增HAS3 5′端片段， 插入到pcDNA3.1DHAS3f3质粒中， 构建pcDNA3.1DHAS3重组质粒并鉴定。
　　
　　用Hind Ⅲ和Sac Ⅱ双酶切质粒pEGFPN1， 回收， 同样方法酶切pcDNA3.1DHAS3， 回收1 700 bp左右片段， 将该回收片段与pEGFPN1酶切产物10∶1混合， 16℃连接过夜， 转化TOP10大肠杆菌， 菌落PCR鉴定阳性克隆， 提取重组质粒pEGFPHAS3， 酶切鉴定。

　　1.2.2 HAS3及HAS3GFP融合蛋白的真核表达 RSC96细胞培养于含有100 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培养液中， 于37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养。于转染前24 h按照1×108个/L数量接种到24孔板中， 转染前换成无双抗的100 mL/L胎牛血清DMEM培养液。转染方法按照lipofectamine 2000说明书进行。转染6 h后， 换新鲜100 mL/L胎牛血清 DMEM高糖培养液继续培养至48 h。收集细胞， TRIzol提取总RNA和总蛋白， 逆转录合成cDNA第1链， 用作PCR模板。根据HAS3 ORF序列， 设计检测用引物， 上游引物为5′TGGCTTCTTTGTGTGGCGTAC3′下游引物为5′TGTATGACTGTGGCGATGAGG3′， 片段大小739 bp。用抗his抗体检测总蛋白中HAS3的表达。荧光显微镜下观察GFP融合蛋白表达情况。

　　1.2.3 巨噬细胞趋化实验 取成年SD大鼠肺， 用PBS灌洗两肺。灌洗液在4℃、 1 000 r/min下离心10 min， 用PBS洗涤细胞团， 重悬于100 mL/L胎牛血清DMEM高糖培养液中， 调整细胞密度至1×1010个/L。趋化实验采用transwell小室， 下室放入RSC96细胞培养上清。取150 μL巨噬细胞悬液滴于膜上， 37℃培养90 min， 用棉花轻擦膜上表面， 将膜反向放入另一培养板中， 甲醇固定10 min后， 用吉姆萨染液染色1 h， 流水洗涤， 晾干。镜下观察膜上染色细胞个数。

　　2 结果

　　2.1 表达载体的构建 pcDNA3.1DHAS3和pEGFPHAS3重组质粒经酶切鉴定与理论大小相符（图1）， 测序结果与GenBank中的参考序列完全一致， 说明目的片段已经正确插入到载体上。

　　图1 重组载体pcDNA3.1DHAS3及pEGFPHAS3的酶切鉴定（略）

　　Fig 1 Restrictive enzyme digestion analysis of recombinant expression vector pcDNA3.1DHAS3 and pEGFPHAS3

　　M: DL 15 000 DNA marker; 1: pcDNA3.1D; 2: pcDNA3.1H3; 3: pEGFPN1; 4: pEGFPH3.

　　2.2 HAS3His与HAS3GFP融合蛋白的真核表达 用pcDNA3.1DHAS3和pEGFPHAS3重组质粒转染RSC96细胞48 h后， 分别通过RTPCR， Western blot和荧光显微镜观察重组蛋白的表达情况（图2、 3）。RTPCR结果显示转染pcDNA3.1DHAS3的细胞有大量HAS3 mRNA的表达， 而转染pcDNA3.1D空质粒的对照组未检测出HAS3mRNA的表达。Western blot结果也显示转染pcDNA3.1DHAS3重组质粒的细胞能检出HisHAS3的表达， 而对照组未检出。转染pEGFPHAS3重组质粒48 h后， 荧光观测重组蛋白的表达情况， 可观察到带有明显绿色荧光的细胞， 并且荧光主要分布于细胞膜上。转染pEGFPN1的对照组也可观察到细胞内的绿色荧光， 但荧光分布于整个细胞基质， 说明HAS3GFP融合蛋白能够定位于细胞膜上， 从而可能具备酶活性。

　　2.3 巨噬细胞趋化实验 检测了过表达HAS3细胞的培养上清对巨噬细胞的趋化活性（图4）。结果显示实验组处理的巨噬细胞的穿膜能力高于对照组， 暗示LWAHA可能参与到炎症反应的过程中。

　　图2 HAS3His融合蛋白在RSC96细胞中的表达（略）

　　Fig 2 Expression of HAS3His fusion protein in RSC96 cells

　　A: RTPCR analysis of mRNA level of HAS3; B: Western blot analysis of HAS3 expression. WT: Wild type; 1: pcDNA3.1; 2: pcDNA3.1DHAS3.

　　图3 HAS3GFP融合蛋白在RSC96细胞中的表达（略）

　　Fig 3 Expression of HAS3GFP fusion protein in RSC96 cells

　　A: pEGFPN1; B: pEGFPHAS3.

　　图4 HAS3过表达培养上清对巨噬细胞穿膜能力的影响（略）

　　Fig 4 Effects of condition medium of HAS3 overexpression RSC96 cells on chemotaxis of macrophages

　　3 讨论
　　
　　HA的作用与其 Mr的大小有关。Mr在200 000左右的LMWHA能够激活核转录因子NFκB， Mr大于6×106的HMWHA却起抑制作用。 Fieber等［4］的研究也发现， LMWHA能够促进MEFs和3LL细胞MMP13和MMP9的表达， 而HMWHA却没有明显作用。此外， HAS3和LMWHA还参与到损伤后炎症过程中。Bai等［5］用HAS3敲除的小鼠研究了小Mr HA在肺损伤中的作用， 发现野生型小鼠在损伤后有明显的白细胞浸润， MIP2和HAS3的表达提高， 而HAS3敲除鼠没有这种表现， 进一步证明了HAS3及LMWHA在肺损伤后的炎症反应中起着关键作用。目前的研究表明， LMWHA似乎更多的参与到损伤及损伤后的炎症反应中， 其机制需要进一步研究。
　　
　　我们在神经损伤及神经源性慢性疼痛的研究中也发现， HA的积累和HAS表达的上调可能参与到神经损伤和疼痛发生中， 因此克隆了大鼠HAS3全长， 进一步研究LMWHA在损伤和炎症中的作用机制。根据已有的研究结果， 我们在损伤神经中检测到HAS3表达， 从cDNA中克隆HAS3全长。最初直接通过PCR扩增HAS3 全长未能扩出条带， 根据进一步分析发现， HAS3 ORF在HAS3 cDNA的位置为1721836， 考虑到逆转录过程中， cDNA可能形成的结构、 5′端的完整性以及长片段高保真酶反应效率， 我们利用HAS3 ORF中的Kpn Ⅰ 酶切位点将HAS3全长分为两段分别扩增， 连接到pcDNA3.1D载体上。结果表明， 相同条件下3′端片段扩增后产物浓度明显大于5′端片段， 说明在最初进行全长扩增时确实在5′端位置遇到障碍， 导致无法直接扩出全长。我们先后将两片段连接到载体后测序表明片段插入正确， 序列与GenBank公布数据一致。我们用pcDNA3.1DHA3转染RSC96细胞， 48 h后通过RTPCR和Western blot检测HAS3表达， 结果野生型和转染空载体的细胞均未检测出HAS3的表达， 而转染pcDNA3.1DHAS3的细胞检测出明显的表达。然后我们通过转染pEGFPHAS3检测GFPHAS3融合蛋白的表达， 对重组HAS3进行定位。与转染pEGFPN1的空载体相比GFPHAS3融合蛋白明显多分布与细胞膜上。
　　
　　在随后的实验中， 我们发现过表达HAS3细胞的培养上清对巨噬细胞具有明显的趋化作用， 也表明在机体损伤后HAS3表达和LMWHA合成的增加可能参与到炎症反应中。从目前报道看， HA对细胞的趋化过程至少有两种可能的途径。一是细胞对HA分子本身的趋向性， Tzircotis等［6］报道部分细胞如MDAMB468和MDAMB231乳腺癌细胞能够在CD44介导下从低浓度HA环境趋向高浓度HA环境， 而NIH3T3细胞则没有这种行为。另一方面， LMWHA能够诱导一些细胞因子的表达， 如IL8， MCP， MIP2等， 趋化炎症细胞向炎症位点浸润。
　　
　　总之， 研究HAS的表达调控、 活性变化对于阐明HA合成机制和功能至关重要。我们克隆出大鼠HAS3基因， 并通过真核表达检测了其活性， 有利于深入研究生理或病理过程中HAS3及HA调控的功能机制。

参考文献

　　［1］ Itano N， Kimata K. Expression cloning and molecular characterization of HAS protein， a eukaryotic hyaluronan synthase［J］. J Biol Chem， 1996， 271(17): 9875-9878.

　　［2］ Spicer AP， Augustine ML， McDonald JA. Molecular cloning and characterization of a putative mouse hyaluronan synthase［J］. J Biol Chem， 1996， 271(38): 23400-23406.

　　［3］ Spicer AP， Olson JS， McDonald JA. Molecular cloning and characterization of a cDNA encoding the third putative mammalian hyaluronan synthase［J］. J Biol Chem， 1997， 272(14): 8957-8961.

　　［4］ Fieber C， Baumann P， Vallon R， et al. Hyaluronanoligosaccharideinduced transcription of metalloproteases［J］. J Cell Sci， 2004， 117: 359-367.

　　［5］ Bai KJ， Spicer AP， Mascarenhas MM， et al. The role of hyaluronan synthase 3 in ventilatorinduced lung injury［J］. Am J Respir Crit Care Med， 2005， 172(1): 92-98.

　　［6］ Tzircotis G， Thorne RF， Isacke CM. Chemotaxis towards hyaluronan is dependent on CD44 expression and modulated by cell type variation in CD44hyaluronan binding［J］. J Cell Sci， 2005， 118: 5119-5128.