大鼠肾脏缺血再灌注损伤过程中水通道蛋白2的表达变化

【摘要】 目的: 研究大鼠肾脏缺血再灌注损伤（IRI）后水通道蛋白2（AQP2）的表达变化与肾功能变化的关系。方法: 建立大鼠左侧肾脏缺血再灌注损伤模型， 于IRI不同的时间点处死大鼠， 留取尿液、 血清、 肾脏标本行尿常规、 肾功能、 肾脏病理形态学及AQP2的免疫组化、 RTPCR检测。结果: 大鼠肾脏IRI后出现尿量增多、 尿渗透压降低， 血肌苷、 尿素氮升高症状; HE染色示肾小管上皮细胞肿胀、 坏死、 脱落; AQP2表达量及其mRNA含量均较对照组减少， 这些变化于IRI 3 d时最低， 至IRI 7 d时恢复正常。结论: 肾脏IRI后AQP2表达的减少可能是急性肾衰竭时尿量增多、 尿渗透压降低的重要因素之一。

【关键词】 肾缺血再灌注损伤 急性肾衰竭 水通道蛋白2

　　缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury， IRI）， 是指发生缺血的组织器官， 当恢复血液灌注后缺血性损伤进一步加重的现象。肾脏作为高灌注器官， 非常容易发生IRI， 临床上因为IRI而导致的急性肾功能衰竭（acute renal failure， ARF）的现象非常多见， 如: 严重的烧伤、 大出血、 感染性休克等均会导致急性肾脏缺血， 当肾脏恢复血液灌注后都会因加重肾脏的缺血损伤而引起ARF［1］。而在肾移植中IRI是造成移植肾原发失功、 移植失败及慢性排斥反应的主要原因之一［2］。因此， 肾IRI时的病理生理变化一直是许多学者研究的重点。水通道蛋白（aquaporins， AQP）是20世纪90年代新发现的一组细胞膜转运蛋白， 普遍存在于动、 植物及微生物中， 自从它被发现以来， 国内外学者对它们进行了大量的研究［3， 4］。目前在哺乳动物已鉴定出 13种水通道蛋白［5］， 其中分布于肾脏的有AQP1、 AQP2、 AQP3、 AQP4、 AQP6、 AQP7、 AQP8［6， 7］。已证明AQP在机体许多生理病理过程起着重要的作用， 但在肾IRI过程中的变化尚不清楚。为此， 我们通过将大鼠右侧肾脏摘除， 左侧肾蒂夹闭40 min后恢复血液灌注， 建立由IRI导致的ARF模型， 观察 AQP2 在肾脏的表达变化及与ARF发展的关系， 以期从新的角度探讨ARF的发病机制， 并为疾病的防治提供理论基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 健康成年雌性Wister大鼠 (质量250±30 g)， 80只， 由大连医科大学动物实验中心提供。实验动物随机分为10组: 对照和缺血再灌注1、 2、 3、 5、 7 d组; 每组8只。AQP2一抗体为兔抗鼠抗体购自武汉博士德公司; 免疫组化用SP试剂盒购自北京中杉金桥公司; AQP2及βactin RNA 引物由大连医科大学生化教研室马郁芳教授惠赠; 琼脂糖电泳DNA 回收试剂盒、 DRR019A mRTPCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 肾缺血再灌注损伤模型的建立 所有实验动物均术前12 h禁食， 自由进水。

　　1.2.2 麻醉方法 实验大鼠应用100 mL/L 水合氯醛300 mg/kg 腹腔注射麻醉。

　　1.2.3 实验组和对照组 参照Kwon等［8］的方法建立肾缺血再灌注损伤模型。具体方法如下: 大鼠麻醉成功后腹部备皮， 取仰卧位， 应用5 mL/L碘伏溶液常规消毒铺无菌孔巾， 取腹部正中切口， 进入腹腔后小心分离并结扎右侧肾蒂后摘除右肾; 游离左侧肾蒂， 用无损伤动脉夹夹闭左侧肾蒂， 阻断出入肾脏血流（在此过程中注意保持实验大鼠体温及减少腹腔的不显性失水）， 40 min后重新恢复肾脏血液灌注。当松开动脉夹后肾脏在2～5 min内颜色由暗红转为鲜红表明缺血再灌注损伤模型建立成功， 肾血管无血栓形成， 关腹。若超过5 min肾脏颜色仍然未转为鲜红色则认为肾脏有血栓形成， 排除出实验组。对照组摘除右肾后， 仅游离左侧肾蒂而不进行夹闭， 40 min后关腹。实验大鼠麻醉清醒后转入代谢笼内自由进水及进食。

　　1.2.4 标本采集 分别于再灌注1、 2、 3、 5、 7 d后处死大鼠， 留取标本。留取实验大鼠处死前24 h尿液标本， 计录尿量及进行尿渗透压检测。经腹主动脉取血6～8 mL静置30 min后1 000 r/min， 离心10 min， 留取血清以行血肌酐及尿素氮检测。取血后迅速摘除大鼠左侧肾脏， 予以用PBS液漂洗冲去血液后分别沿肾脏 冠状面和矢状面将肾脏切为4份， 一份予以用100 mL/L的甲醛PBS液固定以行病理学及免疫组织化学检测， 余下3份于液氮冷冻1 h后转入-80℃冰箱保存以行RTPCR检测。每只大鼠相应检测标本取材部位保持一致。

　　1.2.5 免疫组化和RTPCR实验方法 (1)免疫组化: 肾脏石蜡标本切成厚度为5 μm切片， 经二甲苯、 梯度酒精水化后按SP试剂盒说明书操作步骤依次滴加一抗及二抗后DAB显色1～2 min 。在(×100)倍光镜下每张切片肾小管集合管管腔内膜侧的细胞膜上呈清晰黄褐色颗粒为阳性表达， 随机选取互不重叠的视野5个， 在（×400）倍视野下对阳性表达区进行量化处理。（2）RTPCR实验方法: 应用TRIzol试剂常规一步法提取肾组织标本总RNA， 按DRR019A mRTPCR试剂盒说明书以随机引物（AQP2 RNA引物为上游 5′CGAGCAGTGCTGGCTGAGTTC3′， 下游5′GCTCCTGCAGGCTCTTTGCCG3′共667 bp; βactin RNA引物为上游5′GATATCGCTGCGCTCGTCGTC3′， 下游5′CATGAGGTAGTCTGTCAGGTC3′ 560 bp， RNA引物由大连宝生物试剂有限公司合成)。为模板逆转录合成cDNA， 然后以cDNA作为模板合成DNA。以βactin作为内源性RNA对照， 用βactin校正半定量， 凝胶图像分析系统测定各电泳带灰度值。

　　1.2.6 统计学分析 采用 SPSS12.0 统计软件进行数据处理分析， 检测结果以x±s表示， 两两比较采用LSDt检验。多组间比较采用方差分析。 P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 模型建立情况 所有实验大鼠均于术后30 min内清醒， 1 h内进水。所有实验大鼠无腹腔感染、 大出血等手术并发症发生， 无死亡发生， 术后成活率为100%。

　　2.2 尿液检测 （1）尿量变化: 各对照组间尿量变化无统计学意义（P&>0.05）; 肾IRI组大鼠再灌注 1 d起尿量较对照组增多， 且尿量逐渐增多， 并于再灌注3 d尿量达到最多（P&<0.01）; 以后尿量逐渐减少， 再灌注 7 d恢复正常。（2）尿渗透压检测: 各对照组间尿渗透压变化无统计学意义; 肾IRI组大鼠再灌注 1 d起尿渗透压较对照组明显降低(P＜0.01); 再灌注 3 d达到最低(P＜0.01); 到再灌注 7 d时尿渗透压恢复正常（表1)。

　　2.3 肾功能检测 各对照组间各项肾功能指标变化无统计学意义; 肾IRI组大鼠术后血肌酐和尿素氮较对照组明显升高， 再灌注 3 d达到最高（P＜0.01）， 以后逐渐减少， 于再灌注 7 d恢复正常（表1)。

　　　表1 实验大鼠尿液及肾功能变化（略）

　　bP&<0.01 vs对照组.

　　2.4 肾脏病理学检测 通过对肾脏组织切片HE染色观察发现肾IRI组肾小管上皮细胞较对照组明显肿胀、 坏死、 脱落。这与国内外其他相关文献报道一致（图1）。

　　2.5 AQP2 RTPCR结果 RTPCR 电泳结果显示目的条带在 667 bp处可见 AQP2 mRNA 表达。通过测定各条带光密度值， 计算目的条带与 βactin 条带光密度值的比值表示 AQP2 mRNA 表达的相对强度。在各对照组间， AQP2 mRNA表达量变化无统计学意义; 在 IRI各时相组中， 再灌注1～5 d AQP2 mRNA 表达量较对照组明显下降（0.49±0.03 vs 0.91±0.03， P&<0.01）， 以再灌注 3 d 组 AQP2 mRNA表达下降最明显（0.33±0.03 vs 0.91±0.03， P&<0.01）， 以后逐渐增高， 再灌注7 d 组恢复正常（0.90±0.04 vs 0.90±0.02， P&>0.05）。RTPCR 电泳产物结果(图2)。

　　图1 大鼠肾脏的HE染色（×400） （略）

　　A: 对照组; B: 肾IRI组.

　　图2 AQP2 mRNA变化（略）

　　M: DNA marker; 1: 对照组; 2-6 : 分别为再灌注1、 2、 3、 5、 7 d.

　　2.6 AQP2免疫组化染色结果 AQP2在肾脏表达在肾集合管管腔上皮细胞的管腔膜侧和胞膜下的囊泡中， 免疫组化染色阳性结果表现为集合管主细胞管腔侧的棕黄色染色。免疫组织化学染色结果以 IOD 值表示 AQP2 蛋白的累积光密度值。在各对照组间， AQP2表达量变化无统计学意义; 在对照组可见肾集合管AQP2表达强阳性（图3A）， 在 肾IRI 各时相组中， 再灌注 1～5 d AQP2 表达量较对照组明显下降， 以再灌注3 d组变化最明显（794.90±64.95 vs 3474.61±150.01， P&<0.01）; 以后AQP2表达逐渐增多， 到再灌注7 d时， 与对照组无统计学差异（3359.06±155.04 vs 3483.61±153.01， P&>0.05， 图3）。

　　图3 AQP2免疫组化染色（×400）（略）

　　A: 对照组; B: 再灌注1 d; C: 再灌注2 d; D: 再灌注3 d; E: 再灌注5 d; F: 再灌注7 d.

　　3 讨论
　　
　　临床上ARF有较高的致死率［9］， 因此， ARF时肾脏的病理生理变化， 一直是众多学者研究的重点。当肾脏发生缺血时， 缺血的肾组织氧供减少因而将进行无氧代谢， 进一步导致ATP生成减少［10］， 而近端肾小管和髓袢升支粗段主要利用ATP进行钠离子转运， 而集合管并不参与钠的重吸收， 主要是通过渗透梯度来进行水的重吸收， 故当肾发生局部缺血时， 传统观点认为损伤最明显的部位是肾近端肾小管和髓袢升支粗段而集合管在这一过程中变化应不明显［11］。本实验通过用RTPCR及免疫组化方法检测肾IRI后AQP2及其mRNA变化发现， ARF时肾集合管AQP2的mRNA含量和AQP2的表达量较对照组明显减少， 由此可以推测， 肾集合管也受到明显损伤。本研究还显示， 大鼠肾脏ARF后随着AQP2表达减少， 大鼠尿量增多， 尿渗透压降低; 随着AQP2表达量的恢复， 大鼠尿液变化也渐趋正常， 这表明AQP2在ARF这一病理生理过程中亦起着非常重要的作用， 而且AQP2表达的减少可能是导致ARF后尿液浓缩障碍的重要原因之一。本实验研究表明， 随着术后AQP2表达量的降低和增加， 血肌苷、 尿素氮等肾功能指标出现恶化和好转， 具有一定的关联性， 故AQP2可能也是ARF时反应肾功能变化的重要指标。
　　
　　肾脏通过调节肾小球的滤过率和肾小管的重吸收率之间的变化来调节尿的排泄量。ARF时， 由于肾小球滤过率的同肾小管重吸收率的失调， 而出现尿量的变化。本实验通过将实验大鼠右侧肾脏摘除， 左侧肾蒂夹闭40 min的方法复制中度ARF模型， 研究发现， 与多尿及尿渗透压降低症状所伴随的是肾集合管上有尿液浓缩功能的AQP2表达量明显减少， 以后随着其表达量的逐渐恢复， 模型大鼠的尿量逐渐减少， 尿渗透压逐渐升高， 故可以推测在ARF时出现的多尿症状除了溶质因素导致的渗透性利尿和肾小球的滤过率和肾小管的重吸收率失衡外， 肾小管上皮细胞AQP减少导致的尿液重吸收和浓缩障碍的亦是多尿的原因。
　　
　　这些研究均提示导致ARF时AQP2表达的减少的原因很可能是在肾IRI后所产生的炎性因子及代谢紊乱导致AQP2的调解障碍， 但具体机制尚有待进一步的研究。

参考文献

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