SPTATApoptin融合蛋白对HepG2细胞周期的影响

　　　　 作者：韩苏夏， 马瑾璐， 吕毅， 黄辰， 段康民

【摘要】 目的: 研究SPTATApoptin融合基因诱导人肝癌HepG2细胞凋亡和细胞周期阻滞， 探讨其用于肝癌治疗的可能性。方法: 通过DNA重组技术， 以pcDNA3.1/Apoptin质粒11为模板， 构建SPTATApoptin融合基因 plenti6V5DTOPO真核表达载体。用SPTATApoptinplenti6V5DTOPO真核表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）， 转染后Blasticidin霉素进行筛选， 并进行鉴定得到稳定表达SPTATApoptin的CHO细胞株。收集含有TATApoptin融合蛋白的筛选细胞培养上清， 用于HepG2细胞培养。于共培养后的不同时段收集HepG2细胞， 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡和细胞周期。结果: 用包含SPTATApoptin融合基因的plenti6V5DTOPO真核表达载体瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）， 成功筛选出稳定表达SPTATApoptin融合蛋白的CHO细胞， 收集细胞培养上清， 继续用于HepG2细胞培养， 可观察到HepG2细胞阻滞于G1期并引起细胞凋亡。结论: SPTATApoptin融合表达可引起HepG2细胞的细胞周期G1期阻滞。

【关键词】 信号肽; 蛋白转导域; 鸡贫血病毒; Apoptin蛋白; 肝癌

　　二十世纪九十年代早期， 人们发现由鸡贫血病毒(Chicken anemia virus， CAV)来源的一种小蛋白VP3（Apoptin）能够诱导人转化细胞和肿瘤细胞凋亡， 但对正常的人二倍体细胞无凋亡诱导作用［1］。 Apoptin的肿瘤细胞特异性可能与其在细胞中的亚细胞定位有关， 在转化或肿瘤细胞中Apoptin定位于细胞核， 而在正常细胞中定位于细胞质。Apoptin诱导的细胞凋亡不依赖p53， 且不为Bcl2、 BclxL的过表达所抑制。Apoptin此种特性向我们展示了其在肿瘤治疗领域诱人前景［2］。但是使用传统的转染方法转染并表达活性肽， 因受到转导效率和表达细胞的自杀死亡的限制， 难达到有效治疗实体瘤的目的。HIVTAT是近年来发现的一种新型的高效运输载体蛋白质转导结构 （protein transductIon domains， PTDs） 或称细胞穿膜肽（cell penetrating peptides， CPP）。HIVTAT能穿透细胞膜、 细胞核膜， 携带肽、 蛋白质和 DNA 分子等进入胞质和胞核发挥生物效应， 具有高效性、 无须耗能或通过受体转运的特点， 为提高靶细胞在体内外的基因转移效率和蛋白质表达提供了一个高效、 简便的方法［3］。目前的体内及体外试验显示HIVTAT可以穿过包括神经元细胞在内的所有组织细胞， 且未观察到明显毒副作用［4］。我们构建了带有分泌信号肽、 蛋白转导结构域的融合基因SPTATApoptin从而实现转染细胞转染后的分泌表达TATApoptin融合蛋白的表达方式， 可使融合蛋白进入未转染的肿瘤细胞。希望通过以上设计来实现对肝癌等实体瘤安全有效的特异性治疗。1 材料和方法

　　1.1 材料 大肠杆菌DH5α、 TOPO10B菌种为西北大学生命科学院分子微生物实验室保存; 质粒pLenti6/V5DirectionalTOPO和大肠杆菌Shot Stbl3TM购买于美国Invitrogen公司; 质粒pcDNA3.1(+)/Apoptin［5］为中国军事医学科学院放射医学学研究所孙志贤研究员惠赠。HepG2肝癌细胞系、 CHO(中国仓鼠卵巢细胞)购买于中国科学院上海细胞库。细胞培养于含有10 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培养基中。LipofectamineTM2000脂质体和AntiV5FITC单克隆抗体（mAb）购买于美国Invitrogen公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 SPTATApoptin融合基因真核表达载体的构建 登陆GenBank拷贝鸡贫血病毒， CAV（NC_001427）序列。应用Invitrogen公司生物软件（Vector NTI Advance 9）， 选取Apoptin基因序列（bp 486～852）; 根据文献选取分泌信号肽（signal peptide， SP）序列［6］和TAT的氨基酸序列和核苷酸序列［7］。根据以上序列设计PCR引物: primer1: 5′GTGTGGGCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAATGAACGCTCTG

　　CAGGAAGATACTCC3′; primer2: 5′CTGCAGTCTTATACGCCTTTTTGCGG3′; primer3: 5′CACCATGTGGTGGCGCCTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG3′。 以pCDNA3.1/VP3为模版加入引物1和引物2， pfu DNA合成酶PCR扩增得平末端的含部分信号肽基因序列和TATVP3融合基因(命名为产物1); 以产物1为模版及引物2和引物3， pfu DNA聚链酶PCR扩增得平末端的SPTATVP3重链基因(命名为产物2)。合成的SPTATApoptin融合基因DNA重组双链定向插入plenti6V5DTOPO载体， 转化感受态细胞后扩增提取质粒进行酶切和测序鉴定， 具体试验步骤见文献［8］。

　　1.2.2 稳定表达SPTATApoptin融合基因的CHO细胞的筛选 在6孔板内按1×105细胞/孔接种CHO细胞， 筛选从转染后48 h开始， CHO细胞均以8 mg/L Blasticidin霉素的选择培养基继续培养， 约20 d至1月时出现多个Blasticidin霉素抗性的单克隆， 用消毒后的枪头挑取单克隆细胞入24孔板， 扩大培养， 获得稳定表达SPTATApoptin融合基因的单克隆细胞， 作为稳定转染细胞鉴定用。

　　1.2.3 RTPCR对稳定表达SPTATApoptin融合基因的CHO细胞的鉴定 分别离心收集筛选出稳定表达SPTATApoptin融合基因的单克隆CHO细胞或未转染的CHO细胞， 采用TRIzol RNA分离试剂提取生长状态良好的细胞总RNA， 紫外分光光度计测定总RNA浓度。取5 μg总RNA， 加入1 μL的0.5 g/L oligo(dT)， 按照SuperScriptRT逆转录试剂盒产品说明书操作合成cDNA第一链。将反转录的cDNA-20℃冻存， 以备进行PCR反应。使用引物2和引物3检测融合基因的表达， 使用内参引物（GS 5′caacggatttggtcgtattggg3′; GAS 5′cctggaagatggtgatgggatt3′， 210 bp）进行小鼠GADPH的PCR扩增。PCR条件为: 94℃变性30 s， 50℃退火30 s， 72℃延伸40 s， 共进行30个循环。10 g/L琼脂糖凝胶电泳， 照相。

　　1.2.4 Western blot对稳定表达SPTATApoptin融合基因的CHO细胞的鉴定 分别离心收集筛选出稳定表达SPTATApoptin融合基因的单克隆CHO细胞或未转染的CHO细胞， 用冰上预冷的PBS洗3遍， 用细胞裂解处理细胞收集蛋白， 加入适量蛋白上样缓冲液， 沸水煮5 min， 12 000 r/min离心10 min， 取20 μL 蛋白样品进行SDSPAGE凝胶电泳并将电泳结果进行PVDF转膜， 用一抗即AntiV5FITC mAb(Invitrogen公司， 货号: 554243)， 用PBST按1∶1 000稀释， 膜置于一抗稀释液中室温缓慢摇动1 h。将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体用PBST按1∶200稀释， 膜在二抗中室温缓慢摇1 h。进行Western blot分析， 具体操作步骤见试剂盒的说明书。

　　1.2.5 共培养 收集1×106生长状态良好的HepG2细胞接种于6孔板中， 培养24 h待细胞贴壁后用PBS洗2遍， 加入2 mL稳定表达SPTATApoptin融合基因的CHO细胞培养上清继续培养， 并于共培养后的不同时间收集HepG2细胞进行后续检测。

　　1.2.6 FCM分析共培养后的HepG2细胞周期分析 于共培养后的24 h、 48 h、 72 h和96 h收集每孔中的HepG2细胞， PBS洗2遍， 800～1 000 r/min离心5 min， 弃上清， 加入1 mL生理盐水制成单细胞悬液。加入预冷的无水乙醇2 mL快速混匀， 固定细胞。弃固定液， PBS洗2遍， 1 000 r/min离心5 min， 加入1 mL DNA荧光染料PI， 4℃避光染色15 min， FCM分析。

　　2 结果

　　2.1 SPTATApoptin融合基因真核表达载体的鉴定 设计并合成的SPTATApoptin融合基因DNA双链定向插入plenti6V5DTOPO载体， 转化感受态细胞后扩增提取质粒， 经限制性内切酶EcoR I和Sal I对提取的质粒做双酶切鉴定和测序， 载体构建作用。

　　2.2 Blasticidin霉素筛选浓度确定和筛选稳定表达SPTATApoptin融合基因的单克隆细胞 为了获得SPTATApoptin融合基因表达的单克隆细胞株， 本研究需筛选针对CHO细胞的Blasticidin霉素筛选浓度: 经不同浓度的Blasticidin霉素筛选后， CHO细胞在含100 mL/L FBS、 8 mg/L Blasticidin霉素的DMEM培养液中， 到第8天能杀死所有细胞。因此， 选8 mg/L Blasticidin霉素分别为转染后CHO细胞的筛选浓度。提取筛选出的细胞总RNA， RTPCR扩增， 表明筛选细胞可有效的转录SPTATApoptin融合基因的mRNA。对筛选的CHO细胞裂解液所进行的Western blot检测结果显示表明筛选细胞可有效的表达SPTATApoptin融合蛋白（图1）。

　　2.3 共培养后的HepG2细胞可观察到细胞周期G1期阻滞 共培养后24、 48、 72、 96 h分别进行细胞周期检测发现， 转染SPTATApoptin融合基因表达载体至CHO细胞后的培养上清与HepG2细胞共培养， 可有效引起细胞凋亡、 细胞周期阻滞于G0/G1期(图2）。

　　3 讨论

　　Apoptin以其对肿瘤细胞的选择性诱导、 毒性低等特点， 已经受到了广泛的关注， 成为新型的抗肿瘤候选药物之一。一系列的研究均显示了以Apoptin蛋白为基础的肿瘤特异性治疗的诱人前景［9］。通过将Apoptin基因与其他对肿瘤有治疗作用的基因相连接， 构建融合基因， 而获得对肿瘤有更显著作用的融合蛋白， 也是Apoptin应用研究的一大热点。Guelen等［10］构建了一种新的融合蛋白TATApoptin， 这是一种将TAT跨膜功能域与Apoptin相连接的融合蛋白。将该融合蛋白与细胞共培养30 min后， 其细胞内化高达98%; 24 h后， TATApoptin融合蛋白能诱导大部分的肿瘤细胞凋亡， 而对正常细胞无杀伤活性性。

　　使用传统的转染方法转染并表达活性肽， 因受到转导效率和表达细胞的自杀死亡的限制， 难达到有效治疗实体瘤的目的。采用基因工程， 将编码目的蛋白的基因序列融合到编码信号肽的DNA中可实现外源蛋白的分泌表达， 可以防止宿主细胞对表达产物的降解， 还可以使目的蛋白分泌出胞， 杀伤比邻的未转染的肿瘤细胞， 扩大治疗效应。我们构建了带有分泌信号肽， 蛋白转导结构域的融合基因SPTATApoptin从而实现转染细胞转染后的分泌表达TATApoptin和TATGFP融合蛋白的表达方式， 可使融合蛋白可以进入未转染的肿瘤细胞。我们在前期的实验中证明， SPTATApoptin融合基因转染后可有效的诱导HepG2细胞的凋亡［8］。

　　在本实验中， 我们用连有SPTATApoptin融合基因的plenti6V5DTOPO真核表达载体转染CHO细胞， 并用8 mg/L Blasticidin霉素对转染后的CHO细胞进行筛选。其后， 用RTPCR和Western blot对筛选后的CHO细胞从转录和翻译水平进行鉴定， 证明筛选的CHO细胞可有效的表达SPTATApoptin融合蛋白。收集筛选的CHO细胞的培养上清， 继续用于接种于12孔板的HepG2细胞培养。并于共培养后的不同时间进行细胞周期的检测。共培养后24、 48、 72、 96 h分别进行细胞周期检测发现， 转染SPTATApoptin融合基因表达载体至CHO细胞后的培养上清与HepG2细胞共培养， 可有效引起细胞凋亡， 细胞周期阻滞于G0/G1期。与何等［11］报道的Apoptin可引起肿瘤细胞G2/M期阻滞有一定的差异。这可能与实验方法的不同有关， 因为何等在实验中采用腺病毒方式进行转染， 而腺病毒可引起细胞G2/M期阻滞。至于TATApoptin将细胞周期阻滞于哪一期， 其具体机制如何还有待于实验的进一步验证。

　　总之， SPTATApoptin融合表达可引起HepG2细胞的细胞周期G1期阻滞， 并引起细胞凋亡， 有望发展成为肝癌的等实体瘤的基因治疗策略。

参考文献

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