新疆吐尔扈特蒙古族人群血管紧张素转换酶（ACE）基因多态性分析

　　 作者：冯秀丽， 杨忠伟 ， 江雪萍， 肖白， 梁晓安

【摘要】 目的: 研究新疆地区吐尔扈特蒙古族人群血管紧张素转换酶（ACE）基因插入/缺失多态性分布情况。方法: 采用聚合酶链反应（PCR）分别检测 82例新疆地区吐尔扈特蒙古族正常人群样本的ACE I/D基因型， 分类计数进行统计学分析。结果: 新疆地区吐尔扈特蒙古族正常人的ACE基因3种基因型频率分别为: DD型 24.39%， ID型 26.83%， Ⅱ型 48.78%。D和I等位基因频率分别为37.80%和62.20%。结论: ACE基因多态性的分布与性别无关， 新疆地区吐尔扈特蒙古族人群ACE基因频率分布与日本人相近， 但DD型及D等位基因频率低于欧美人群。

【关键词】 血管紧张素转换酶; 多态性; ACE基因

　　血管紧张素转换酶（angiotensinconverting enzyme， ACE）是调节心血管和泌尿过程的肾素血管紧张素系统的关键酶之一。人类ACE基因位于17号染色体长臂q23位点， 长度为21 kb， 包括26个外显子和25个内含子， 其中第16内含子存在一段287 bp的DNA序列的插入（I）或缺失（D）， 构成ACE基因I/D多态性［1］。这种基因多态性分布， 将有助于从分子水平对心血管疾病的发病率与不同种族间的差异提供依据。国内各地关于ACE基因多态性的研究已有报道［2-4］， 但在新疆地区尚未见系统报道。本研究旨在了解新疆地区吐尔扈特蒙古族正常人群ACE基因I/D多态性分布情况。

　　1 材料和方法

　　1．1 研究对象 随机抽取 82例（男44例， 女38例; 年龄20～65岁）新疆地区吐尔扈特蒙古族无血缘关系健康人群静脉血3 mL， EDTA.K2抗凝， 充分混匀后放入-20℃冰箱冷藏室保存待检。经检查已排除冠心病、 高血压、 糖尿病及脑血管病。MastercyclerReppendorf PCR仪（梯度核酸扩增仪）， 购自上海艾本德生物技术国际贸易有限公司; 20 g/L琼脂糖凝胶电泳 EB染色上海生工生物工程有限公司试剂盒。UVP AC暗箱+GEL相机凝胶成像仪， 购自天美有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 DNA的提取 取冷藏保存的抗凝全血2.5 mL于1.5 mL离心管（EP）中， 加双蒸水振荡使红细胞破裂， 15 000 r/min， 离心15 min， 留取白色沉淀， 用酚氯仿异戊醇法提取DNA: 取50 μL WBC加入600 μL TES充分颠倒混匀; 加入100 g/L SDS 50 μL; 加入20 g/L蛋白酶K2.5 μL， 充分颠倒混匀; 37℃水浴过夜; 加入等体积酚（约700 μL）， 颠倒混匀2 min， 10 000 r/min， 离心5 min， 取上清液; 重复上述步骤。加入等体积氯仿异戊醇（24∶1）， 颠倒混匀2 min， 10 000 r/min， 离心5 min， 取上清液。加入2倍体积的冷无水乙醇（-20℃冰箱中储存的）颠倒混匀， 置-20℃冰箱沉淀＞30 min。12 000 r/min， 离心20 min（4℃）， 弃上清。加入750 mL/L乙醇1 mL， 小心洗涤沉淀（弹、 颠倒混匀）， 12 000 r/min， 离心10 min， 弃上清。静置10～20 min， 待管壁残留的乙醇挥发干净后， 将沉淀溶于50 μL去离子水中即含DNA。

　　1.2.2 引物设计与合成 参照文献［1］设计引物: primer上游引物5′CTGGAGACTCCCATCCTTTCT3′; 下游引物: 5′GATGGCCATTCGTCAGAT3′。

　　1．2.3 PCR扩增 反应体系为15 μL， 包括DNA模板0.8 μL、 10×Buffer (Mg2+) 1.5 μL， dNTPMix1.2 μL， primer F引物0.1 μL ， primerR引物0.1 μL Taq polymerase 0.1 μL， pure water 11.2 μL。PCR仪扩增反应条件: 参数为95℃预变性2 min， 95℃变性30 s， 58℃退火45 s， 72℃延伸45 s， 共35个循环， 最后72℃延伸5 min。

　　1．2.4 PCR产物鉴定 20 g/L琼脂糖凝胶电泳， 100 V， 30 min， 置凝胶成像仪上观察特异性条带， 打印并记录实验结果。

　　1．2.5 统计学分析 计算出新疆地区吐尔扈特蒙古族人群中ACE基因各基因型频率和等位基因频率， 经过Hardy Weinberg遗传平衡定律检验， 表明各基因型频率已达遗传平衡， 具有群体代表性。各组间频率比较用χ2检验。P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2．1 电泳结果 经PCR反应， 得到3种基因型: DD型（缺失纯合子， 只含190 bp片段）， ID型（缺失与插入杂合子， 含190 bp和490 bp两种片段）， Ⅱ（插入纯合子， 只含490 bp片段）， 结果见图1。

　　2．2 新疆地区健康吐尔扈特蒙古族人群ACE基因频率 在82例样品中， DD型20例， ID型 22例， Ⅱ型 40例， 3种基因型的频率分别为24.39%、 26.83%和48.78%; D、 I等位基因的频率分别为 37.80%和 62.20%。经χ2检验， 这些比例与Hardy Weinberg平衡相一致（χ2=0.4289， P＞0.05）， 具有群体代表性。等位基因型频率分布男女间无统计学意义（表1）。表1 新疆吐尔扈特蒙古族健康人群ACE基因型及等位基因频率分布注: 括号内数字为不同基因型频率.

　　2．3 不同种族正常人群ACE基因频率比较 正常人群与日本人群基因型分布和等位基因频率相近， 但与欧美人群有较大差异。新疆蒙古族与日本人群DD基因型频率和D等位基因频率所占比例低于Ⅱ基因型频率， 而欧美人群DD基因型频率和D等位基因频率所占比例高于Ⅱ基因型频率（表2）。表2 不同种族人群ACE基因型及等位基因频率比较

　　3 讨论

　　自1990年Rigat等［1］发现人ACE基因16内含子存在插入（I）/缺失（D）多态性后， ACE基因多态性与各种疾病的关系受到广泛关注， 近年来迅速发展的分子生物学实验技术及遗传流行病学方法为疾病的易感基因研究提供了方法和手段。我们用PCR方法研究了新疆地区吐尔扈特蒙古族正常人群ACE基因多态性的分布特点， 本研究人群基因型分布符合Hardy Weinberg遗传平衡， 说明样本来自同一人群， 其结果具有代表性。结果显示: 新疆地区吐尔扈特蒙古族正常人ACE的DD、 ID、 Ⅱ基因型频率分别为24.39 %、 26.83 %、 48.78 %。男女性别之间差异无统计学意义。将本实验结果与不同人群比较， 新疆地区吐尔扈特蒙古族正常人群ACE基因多态性的分布， 从世界范围来看， 新疆地区吐尔扈特蒙古族正常人群ACE基因多态性分布与日本人群差异无显著性， 而与英国、 美国、 德国人群相比较则差异显著。结果提示正常人群ACE基因多态性分布存在民族差异。研究结果已公认在3种基因型中， 血浆ACE水平以Ⅱ型人群最高， DD型人群最低， ID型人群介于二者之间。高活性的ACE被认为是某些心血管疾病、 肾病、 糖尿病的危险因素， 研究比较国人及国外不同民族群体的遗传特点， 对于从分子流行病学角度了解ACE基因多态性在我国人群中的分布， 对认识一些疾病在不同地区、 不同种族表现出来的差异具有重要意义。本研究也为新疆地区吐尔扈特蒙古族ACE基因多态性与多种疾病（如高血压、 冠心病、 糖尿病肾病等）的关系提供了理论基础。

参考文献

［1］ Rigat B， Hubert C， AlhencGelas F， et al. An insertion/deleton Polynerphism in the angiotensin Iconverting enzyme gene accounting for half the variance of serum enzyme levels［J］. J Clin Invest， 1990， 86(4): 1343-1346.

［2］ 庞小芬， 巩方霞， 朱理教， 等. 上海地区正常人ACE基因多态性频率的分布［J］. 高血压杂志， 2001， 9(4): 294-296.

［3］ 廖宝平， 孙筱放， 潘倩莹， 等. 广东汉族人群血管紧张转换基因（ACE）多态性研究［J］. 中国优生与遗传杂志， 1999， 7(4): 10-11.

［4］ 吴红梅， 屈遂林， 黄 倩， 等. 成都地区汉族人群ACE基因多态性与血清ACE活性的相关性［J］. 华西医大学报， 2000， 31(2): 169-170.