人核迁移蛋白单克隆抗体的制备及其在人巨核细胞中的表达

【摘要】 目的: 制备人核迁移蛋白（hNudC )的单克隆抗体（mAb）并鉴定其特性。方法: 从人胎肝组织中克隆得到 hNudC 基因， 构建重组表达质粒 pET28b/hNudC， 表达带有6His标记的重组hNudC， 用纯化的重组 hNudC 蛋白免疫 BALB/c小鼠制备mAb， 用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆， 用免疫荧光染色法及Western blot 试验鉴定 mAb 的特异性。结果: 获得2株杂交瘤细胞系2C16和2D8， 其分泌的mAb的 Ig亚类(型)分别为IgG1 和IgM(κ) ， 杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶64和1∶32; 腹水mAb的效价分别为1∶1×105和1∶5×104。mAb与重组hNudC蛋白有较强的特异性反应， 免疫荧光染色和Western blot试验证明， 制备的 mAb 可以识别人巨核系白血病细胞株 Dami、 Meg01和人脐带血来源的CD41＋巨核细胞中表达的 hNudC 蛋白。结论: 成功地制备了特异性抗 hNudC mAb， 为研究 hNudC 蛋白的功能、 天然分布及异常表达奠定了基础。

【关键词】 人核迁移蛋白; 单克隆抗体; 巨核细胞

　　人核迁移蛋白C 基因(human nuclear distribution C， hNudC)， 定位于第1号染色体1p34p35， 编码331个氨基酸， 基因全长为8 kb。NudC进化上保守， 从构巢曲霉、 果蝇、 小鼠等生物均能找到同源物， 人类 NudC羧基末端的94个氨基酸与构巢曲霉的同源性为67%， 与果蝇的同源性为76%， 与大鼠的同源性为98%。NudC的C末端12个氨基酸， 在所有的种类中都被保留［1］。hNudC在人体组织中广泛表达， 提示hNudC具有重要的生物学功能［2］。早期的生物学活性的研究表明， hNudC与其家族成员(包括胞质动力蛋白、 肌动蛋白、 LIS1和NUDE)相互作用， 和微管一起参与细胞增殖［3］、 正常的造血［4］、 神经细胞形成等。近期研究进一步证明， hNudC在促进造血细胞生长中起着功能性作用［5］。这些资料为 hNudC的功能研究提供了新的方向。

　　为了进一步研究hNudC蛋白的结构与功能， 探索hNudC对于造血细胞的增殖、 分裂的功能和影响， 迫切需要hNudC的特异性抗体， 但现在并无相应市售抗体。为此， 本研究拟用纯化的重组hNudC蛋白为免疫原， 利用经典的淋巴细胞融合技术， 建立稳定分泌特异性单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株， 并对得到的mAb进行鉴定， 检测hNudC蛋白在人巨核细胞中的表达情况和亚细胞定位， 为进一步探讨hNudC蛋白的结构和功能提供工具。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 弗氏完全佐剂购于Sigma公司。蛋白表达载体pET28b(+) 购自Invitrogen公司; 工具酶购自MBI Fermentas公司; 质粒DNA提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒购自Omega公司; 亲和层析柱TALON Spin Column购自CLONTECH公司; Dynal CD34 祖细胞分选系统 Prod.No. 113.01购自 Dynal Biotech， Norway公司。造血干细胞无血清培养液StemSpan h3000购自Stem Cell Technologies公司; 淋巴细胞分离液FicollPaqueTM Plus (1 077 g/L)购自Amersham Biosciences公司。IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)培养基粉末: 购自Gibco公司; 胎牛血清FBS购自Gibco公司。重组人的rhTPO购自于Sigma公司。FITC 标记的CD41 mAb、 藻红蛋白（PE）标记的二抗兔抗鼠IgG（H+L）、 FITC 标记的二抗兔抗鼠IgG（H+L）等抗体购自于Southern Biotechnology Associates公司。BALB/c小鼠和健康成年雄性Wistar大鼠由中山大学实验动物中心提供。白血病巨核细胞系Dami、 Meg01购自中国科学院上海细胞库。其他化学试剂购自Sigma 公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 外源基因蛋白的表达和纯化 将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)， 挑取单个克隆接种于LB/Kan (50 mg/L)培养液中， 37℃培养过夜。取上述过夜菌液按比例接种于新鲜的LB/Kan培养液， 剧烈振荡， 37℃培养2～3 h至A600为0.5～0.6， 加异丙基硫代BD半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.5 mmol/L， 30℃继续继续剧烈振荡培养3 h 。离心收集菌体沉淀， 超声波破碎细胞壁后， 常规TALON Metal Affinity Resin 亲和柱进行蛋白纯化， 最后用FPLC System色谱仪进一步纯化表达产物。电泳鉴定目的蛋白的相对分子质量（Mr）和表达产量。透析过夜， BioRad法测定蛋白质浓度后， -80℃保存备用。

　　1.2.2 杂交瘤细胞的建立 用0.5 mL纯化的hNudC 蛋白(1.7 g/L)与等量福氏完全佐剂混合并完全乳化后， 经腹腔注射免疫BALB/c小鼠(0.1 mL/只) 。加强免疫时， 用福氏完全佐剂充分乳化抗原， 注射剂量和部位同前， 共免疫4次， 每次间隔2周。最后1次直接用抗原溶液进行免疫。末次免疫后3 d， 取脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0在PEG4000作用下融合。用间接ELISA法筛选mAb分泌阳性的杂交瘤细胞。经3～4次有限稀释法克隆化后， 选择2株mAb分泌持续阳性的杂交瘤细胞扩大培养， 并按常规制备腹水。

　　1.2.3 mAb的效价测定 采用间接ELISA法。用hNudC (1 mg/L)包被聚苯乙烯板。一抗为适当稀释的杂交瘤细胞培养上清或腹水样本， 二抗为1∶3 000的HRP－羊抗鼠IgG， 经TMB底物显色后， 于波长450 nm测定A值。

　　1.2.4 Ig亚类(型)的鉴定 参照试剂盒中的说明书进行。用PBS将杂交瘤细胞培养上清进行10倍稀释， 取150 μL滴加到测试管中， 使蓝色胶乳完全重悬。将抗体测定试纸条的黑色一端插入到试管的底部， 待蓝色的阳性控制线条出现时， 取出测试条， 2 min后读取结果。

　　1.2.5 抗血清反应特性的Western blot 分析 将hNudC 蛋白进行 SDSPAGE分离， 电转移到硝酸纤维素(NC) 膜上， 在封闭液中37℃缓慢摇动2 h ， 用洗涤液洗3次， 与10-3稀释的 hNudC mAb 在37℃孵育1 h ， 用洗涤液洗3 次， 每次15 min; 与适当稀释的兔抗鼠 IgGHRP 在37℃孵育1 h ， 用洗涤液洗3 次， 每次15 min; BCIP/NBT显色液中显色数分钟， 待目标条带显色清晰时， 将NC膜转移到PBS 中停止显色， 拍照记录结果。

　　1.2.6 人脐血来源的巨核细胞CD41+培养 每份脐血均取自广东省造血干细胞库。选择年龄在24～35 岁的足月妊娠健康产妇， 无肝炎、 结核等各种妊娠并发症， 样品经正式同意后来自足月分娩的胎儿。在无菌条件下采集样品， 脐血平均采集量为50～80 mL， 4℃冰箱存放。免疫磁珠分离法体外分离脐血中CD34+细胞， 无血清液体培养体系中加入50 μg/L TPO促进 CD41+巨核细胞生长， 37℃、 50 mL/L CO2条件下共同培养， 每3～4 d半量换液1 次， 培养8 d后收集CD41+细胞。

　　1.2.7 白血病巨核细胞系的培养 白血病巨核细胞系Dami、 Meg01均用含100 mL/L小牛血清DMEM培养基常规培养。细胞置于37℃孵箱中， 在50 mL/L CO2条件下培养。

　　1.2.8 hNudC蛋白在人巨核细胞的分布 培养收集人巨核细胞CD41+细胞， 调整细胞密度为1×105个/L; 取细胞混悬液， 滴入经过L多聚赖氨酸处理后的玻璃载玻片上， 放入湿盒中孵育过夜贴壁， 用40 g/L多聚甲醛固定45 min; 与1∶1 000稀释后的hNudC mAb孵育1 h; 然后与1∶1 000稀释后的PE标记的二抗兔抗鼠IgG孵育1 h; 用PBS缓冲液5 min×3次， 与1∶1 000稀释后FITC标记的CD41 mAb孵育1 h; PBS缓冲液5 min×3次， 与DNA核染料1 000 μg/L DAPI， 4℃孵育15～30 min。PBS缓冲液5 min×3次， 封片， 在荧光显微镜下观察计数， Nikon COOL PIX4500数码相机摄影记录。

　　1.2.9 hNudC蛋白在白血病巨核细胞系的分布 Dami、 Meg01细胞培养、 收集、 固定等方法同1.2.8， 与1∶1 000稀释后的hNudC mAb孵育1 h; 与1∶1 000稀释后的FITC标记的二抗兔抗鼠IgG孵育1 h; 用PBS缓冲液5 min×3次， 与DNA核染料1 000 μg/L DAPI， 4℃孵育15～30 min。PBS缓冲液5 min×3次， 封片， 在荧光显微镜下观察计数， Nikon COOL PIX4500数码相机摄影记录。

　　1.2.10 hNudC蛋白在人巨核细胞和白血病巨核系细胞株中的表达 收集对数生长期的人巨核细胞与Dami、 Meg01细胞株， 在500 μL细胞裂解液（含Protease Inhibitor Cocktail）中快速匀浆。4℃抽提1.5 h， 4℃ 12 000 r/min离心15 min， 吸取上清提取人巨核细胞与Dami、 Meg01细胞株的总蛋白分装-80℃冻存。制作蛋白质标准曲线， 测定所提取的蛋白浓度。使用Western blot 分析hNudC蛋白在人巨核细胞和白血病巨核系细胞株中的表达， 每组样品均重复2次。

　　2 结果

　　2.1 杂交瘤细胞株的建立 细胞融合后， 共有84个微孔有杂交瘤细胞克隆生长， 其中有12个微孔能够检测到抗体， 经3～4次克隆化培养后， 获得2株（2C16和2D8）可稳定分泌抗 hNudC mAb的杂交瘤细胞。将其体外连续培养1个月后液氮冻存， 复苏后仍能稳定分泌抗 hNudC mAb。

　　2.2 mAb的特性鉴定 （1）效价测定: 杂交瘤细胞2C16和2D8培养上清中mAb的ELISA效价分别为1∶64和1∶32; 腹水mAb的效价分别为1∶1×1∶105 和1∶5×104。（2）Ig亚类(型)鉴定: 采用Isotrip试剂盒对2株mAb 2C16和2D8的Ig亚类(型)进行鉴定， 结果表明二者分别为IgG1和IgM， 轻链均为κ型。

　　2.3 Western blot分析抗血清的特异性 用SDSPAGE和Western blot检测抗hNudC mAb对抗原的识别， 结果显示均在Mr 45 000处出现条带， 与重组表达hNudC的大肠杆菌的hNudC大小一致（图1）， 说明该抗体可以识别大肠杆菌重组表达的hNudC， 该抗体具有很高的特异性。

　　2.4 hNudC蛋白在人巨核细胞的表达 红色荧光标记的是hNudC， CD41FITC标记为绿色荧光的是人巨核细胞， 细胞核使用DAPI染色标记为蓝色荧光。可以看出， hNudC在人巨核细胞的大部分细胞膜上点状分布， 有些部位深， 有些部位浅; 胞质内的染色呈区域性（图2）。

　　2.5 hNudC 蛋白在巨核系白血病细胞株Meg01、 Dami的表达 FITC标记为绿色荧光的是hNudC蛋白， 细胞核使用 DAPI 染色标记为蓝色荧光。hNudC在巨核系白血病细胞株Meg01、 Dami大部分细胞膜上有不连续的线状着色， 胞质内的染色亦呈区域性（图3）。

　　2.6 hNudC蛋白在人巨核细胞和白血病巨核系细胞株中的表达 hNudC蛋白在Dami、 Meg01细胞株和人脐带血来源的巨核细胞中也有强的表达（图4）。 每组样品均重复2次都得到了相同的结果， 提示hNudC 蛋白特异性地表达于人的巨核细胞中。

　　3 讨论

　　巨核细胞增殖成熟过程是一个复杂的、 多阶段的细胞分化过程， 包括细胞分化、 增殖、 成熟， 最终产生血小板并释放进入血液循环。血小板生成素（thrombopoietin， TPO）是巨核细胞系的主要调控因子， 具有特异性刺激巨核细胞系祖细胞增殖与分化、 促进巨核细胞成熟、 提高外周血中血小板数目的作用［6］。但有研究认为血小板生成素TPO虽然在巨核细胞成熟过程中的早期具有非常重要的作用， 但是却对后期的血小板释放过程没有作用［7］。因此推测， 很可能存在有其它因子， 与TPO一起参与巨核细胞和血小板生成的调控过程。

　　许多研究表明hnudC基因在细胞增殖和正常的造血中起着重要的作用［5］。在正常人骨髓中的早期骨髓祖细胞和红系祖细胞中， hNudC 蛋白和mRNA都有高水平表达。另外， 与正常细胞水平比较， 从急性淋巴细胞性白血病(ALL)和急性骨髓白血病(AML)患者抽吸的骨髓中的hNudC显著增高了50倍， 表明hNUDC表达量的上调是白血病发生过程的一部分［8］。因此， hNudC在促进造血细胞生长中起着功能性作用， 并与白血病的发生有关。

　　本课题组前期实验结果表明， hNUDC与TPO具有共同的受体， hNUDC可以特异地与血小板生成素受体（Myeloproliferative leykemia， Mpl）特异地结合， 而且发现hNUDC对于小鼠的巨核细胞系和血小板的生成， 具有与TPO类似的生物活性［9］， 因此初步表明hNUDC很有可能是巨核细胞增殖分化调控中一个重要的因子。

　　本研究使用重组人 hNudC 蛋白， 成功地建立了稳定分泌抗 hNudC mAb的杂交瘤细胞株。通过EL ISA、 Western blot 以及免疫荧光技术， 证明 hNudC的mAb效价高、 特异性好。利用制备的hNudC mAb， 采用免疫荧光技术， 检测了hNudC 蛋白在人巨核细胞中的表达情况和亚细胞定位， 显示hNudC 蛋白呈点状分布于人巨核细胞、 巨核系白血病细胞株Meg01、 Dami的细胞膜与细胞核中， 这些结果为进一步探讨hNudC 蛋白在巨核细胞的增殖、 分化过程中的作用奠定了研究基础。因此， 抗hNudC mAb的成功制备对于深入研究 hNudC 蛋白的生物学效应， 寻找hNudC 相互作用的蛋白， 检测人体内 hNudC 各组织器官的分布、 生理和病理情况下的变化， 以及明确 hNudC 蛋白发挥效应的分子机制等研究具有重要意义。

参考文献

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