使用抗氧化剂调控胞内的ROS对脐血CD34+细胞体外扩增特性的影响

【摘要】 目的: 使用抗氧化剂调控胞内活性氧物质(ROS)水平， 考察其对脐血CD34+细胞体外扩增特性的影响。方法: 在体外培养过程中， 分别采用超氧化物歧化酶（SOD）、 过氧化氢酶（CAT）或N乙酰半胱氨酸（NAC）3种抗氧化剂降低脐血CD34+细胞内的ROS水平， 研究了CD34+细胞在抗氧化剂清除ROS后的体外扩增特性。结果: 体外培养时细胞因子的应用会使细胞内的ROS水平显著上升。3种抗氧化剂均能有效地清除细胞内ROS， 且清除程度随使用剂量的改变而变化。在培养体系中添加2 000 U/mL SOD、 200 U/mL CAT 或2 mmol/L NAC， 扩增后培养物中CD34+细胞及CD34+CD38-细胞的比例、 集落生成细胞的密度均有明显提高， 但对CD34+细胞扩增倍数影响不大; 而加入8 000 U/mL SOD、 1 000 U/mL CAT 或5 mmol/L NAC， 抑制CD34+细胞的扩增能力。结论: 采用细胞因子体外扩增脐血CD34+细胞时， 使用低剂量的抗氧化剂适度清除细胞内的ROS， 明显提高培养物中造血干/祖细胞的含量， 同时并不影响扩增后CD34+细胞的再扩增能力。

【关键词】 活性氧（ROS） CD34+造血干/祖细胞 体外扩增 抗氧化剂

　　造血干细胞(hematopoietic stem cells， HSC)被广泛地应用于干细胞移植、 生物免疫治疗、 细胞治疗和基因治疗等领域， 但细胞数量不足是限制其应用的瓶颈。尽管造血干细胞体外扩增能有效地解决这一问题， 但不少研究发现体外扩增很可能会导致其细胞功能的损伤［1， 2］。所以如何在体外模拟造血环境， 以获得高活性的造血干/祖细胞是近年来该领域的研究热点。目前， 人们研究HSC体外培养仅仅局限于细胞因子组合、 溶氧、 基质共培养、 动态搅拌等外界培养条件的控制［3］， 但关于体外因素是通过何种途径影响细胞功能、 以及如何调控胞内活性物质以提高细胞活性的研究很少。
　　
　　本研究室在比较分析了培养前后脐血CD34+细胞基因表达差异， 发现细胞的抗氧化酶基因表达有明显不同［4］， 提示体外培养对HSC胞内的氧化还原水平有重要影响。活性氧物质(reactive oxygen species， ROS)是细胞内氧代谢的副产物， 其在细胞内的一系列生理活动中作为信号分子发挥作用， 如调控细胞的增殖、 分化、 衰老及凋亡［5］。我们曾研究了氧压对CD34+细胞扩增的影响， 发现细胞内ROS的生成随氧压的降低而减少， 而降低CD34+细胞扩增过程中细胞内ROS水平有利于扩增后细胞功能的维持［6］。为此， 本研究进一步使用不同剂量及种类的抗氧化剂调控胞内ROS水平， 考察其对脐血CD34+细胞体外扩增特性的影响。期望通过适度地调控体外扩增过程中CD34+细胞的氧化还原水平， 获得更好的扩增效果。

　　1 材料和方法

　　1.1 脐血来源与脐血CD34+细胞的分离 脐血由上海国际和平妇婴保健院提供。脐血经淋巴细胞分离液梯度离心后， 收集单个核细胞， 并以IMDM培养基洗涤2次后备用。采用MiniMACS免疫磁性吸附柱分离装置进行CD34+细胞的纯化， 按照CD34+细胞选择试剂盒（Milienyi Biotech）说明书进行操作即获得纯化的CD34+细胞， 经过流式细胞术（FCM）分析， 分离后的CD34+细胞纯度在95%以上。

　　1.2 CD34+细胞的体外培养 体外培养基本培养基用IMDM（Gibco）， 添加200 mL/L胎牛血清， 采用的细胞因子组合为SCF+IL6+IL3， 其浓度分别为: 50、 20、 5 μg/L。超氧化物歧化酶SOD(浓度分别为2 000和8 000 U/mL); 过氧化氢酶CAT(浓度分别为200和1 000 U/mL); N－乙酰半胱氨酸NAC(浓度分别为2和5 mmol/L)与细胞因子一同加入到培养基中。细胞以1×109/L密度接种于24孔板， 每孔2 mL， 于37℃、 50 mL/L CO2培养箱中进行培养， 当培养至第4天时半量稀释换液（即取出一半的培养基和细胞， 补加相同体积的新鲜培养基、 细胞因子及相应的抗氧化剂)。在培养过程中， 以不加抗氧化剂进行常规培养为对照组， 加入2 000 U/mL SOD、 200 U/mL CAT或2 mmol/L NAC进行培养为低剂量组， 加入8 000 U/mL SOD、 1 000 U/mL CAT或5 mmol/L NAC为高剂量组。以培养7 d后进行细胞记数并检测培养物中CD34+细胞比例， 计算CD34+扩增倍数， 以评价CD34+细胞的扩增能力。

　　1.3 造血细胞的集落检测 集落检测体系为IMDM培养基， 含200 mL/L胎牛血清（FBS）、 9 mg/L甲基纤维素(Sigma)以及人重组造血生长因子SCF、 IL6、 IL3， GMCSF、 GCSF、 EPO。培养在24孔板中进行， 每孔装半固体培养基500 μL， 加入1×104个单个核细胞。在37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度的培养箱中培养14 d后在显微镜下进行集落计数， 超过50个细胞的细胞簇为一个集落。

　　1.4 细胞内ROS水平的检测 使用双氢乙酰乙酸二氯荧光黄（DCFHDA）标记细胞内的ROS后， 用FCM检测。DCFHDA自由扩散进入细胞后被酯酶催化变成DCFH， 在活性氧存在下被氧化成DCF， DCF荧光密度与细胞内活性氧水平成正比。DCF的激发波长为485 nm， 吸收波长为530 nm。具体操作时， 收集1×106个细胞， 用PBS洗涤后， 加入0.5 mL PBS液悬浮， 加入10 mmol/L的DCFHDA液0.5 μL， 使其终浓度为100 mol/L， 在37℃避光温育20 min， 用PBS洗涤3次， 用流式细胞术检测。

　　1.5 细胞表型的检测 收集1×106个细胞， 用抗体稀释液洗涤后2遍后， 加入PECD34抗体10 μL和FITCCD38抗体10 μL， 在4℃孵化30 min， 再用抗体稀释液洗2遍， 加入500 μL 抗体保存液保存， 每份样品留一半做空白对照。用FCM检测。

　　1.6 统计学分析 所有实验均重复3～5次， 数据以mean±SD表示， 不同组间的显著性采用t检验， P&<0.05的差异具统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 培养过程中细胞内ROS水平的变化 在培养过程中检测CD34+细胞内的ROS水平， 用DCF的荧光密度值表示。将扩增后CD34+细胞内的DCF值与新鲜CD34+细胞内的测得的DCF值（F0）相比， 得到每个样品DCF的相对荧光强度（图1）。从图1可见， 培养1～7 d， 只加入细胞因子的control组细胞内ROS水平呈现出不断上升的趋势， 而未加入细胞因子的一组， 细胞内ROS水平基本保持不变， 表明细胞因子对细胞的刺激可能是导致细胞内ROS水平上升的原因。

　　图1 培养过程中CD34+细胞内DCF的相对荧光强度变化（略）

　　Fig 1 Change of relative fluorescence density of DCF in CD34+ cells ex vivo culture(n=3)

　　同时还可以看出3种抗氧化剂均能有效地清除ROS， 清除的水平随使用剂量的改变而变化。加入2 000 U/mL SOD、 200 U/mL CAT或2 mmol/L NAC能使细胞内的ROS水平大致降低到与培养到相同时间的对照组细胞的58%～65%。而采用8 000 U/mL SOD、 1 000 U/mL CAT或5 mmol/L NAC则可使细胞内ROS水平基本维持在与未加入细胞因子组的ROS水平相同的状态。

　　2.2 清除细胞内ROS对CD34+细胞扩增的影响 进一步考察了在培养过程中采用3种抗氧化剂清除细胞内的ROS后， 对CD34+细胞体外扩增特性的影响。添加抗氧化剂对培养7 d 后CD34+细胞扩增倍数的影响如图2所示。加入2 000 U/mL SOD、 200 U/mL CAT或2 mmol/L NAC（低剂量组）清除活性氧后， 细胞的扩增倍数与对照组没有明显的差别， 而加入8 000 U/mL SOD、 1 000 U/mL CAT或5 mmol/L NAC（高剂量组）后， CD34+细胞几乎不扩增。说明适度清除ROS并不影响CD34+细胞的扩增， 但过量清除ROS， 则会导致细胞不再扩增。

　　图2 培养7 d时CD34+细胞的扩增倍数（略）

　　Fig 2 The fold expansion of CD34+ cells at day 7 (n=3)

　　aP&<0.05 vs control group.

　　2.3 清除细胞内的ROS对造血干/祖细胞含量的影响 培养物中集落形成单位的密度可以反映出造血干/祖细胞的维持情况。体外培养7 d后培养物中集落形成单位的密度如图3所示， 加入2 000 U/mL SOD、 200 U/mL CAT或2 mmol/L NAC（低剂量组）清除细胞内的ROS， 均可显著提高培养物中的集落密度。而加入8 000 U/mL SOD、 1 000 U/mL CAT或5 mmol/L NAC（高剂量组）后， 培养物中的集落密度下降到对照组的50%以下。可见， 适当清除细胞内的ROS， 有利于造血干/祖细胞的维持。

　　图3 抗氧化剂对培养7 d后的集落生成细胞能力的影响（略）

　　Fig 3 Effect of antioxidant on the CFCs colony productivity of the cultured cells at day 7 (n=5)

　　aP&<0.05 vs control group.

　　而CD34+是造血干/祖细胞的表型标志， CD34+CD38-细胞代表了更为原始的造血干/祖细胞， 进一步分析培养物中CD34+、 CD34+CD38-细胞的比例， 结果见表1。使用低剂量的抗氧化剂清除细胞内的ROS， 可明显提高培养物中CD34+细胞与CD34+CD38-细胞的比例， 说明在培养过程中清除细胞内的活性氧， 有助于较原始的造血干/祖细胞的维持。

　　表1 培养7 d后培养物中CD34+细胞与CD34+CD38-细胞的含量（略）

　　Tab 1 The percentage of CD34+ and CD34+/CD38- subsets in the cultured cells at day 7

　　aP&<0.05 vs control group.

　　2.4 清除细胞内ROS对扩增后CD34+细胞再扩增能力的影响 在含有 SCF/IL6/IL3细胞因子的培养基中分别加入3种抗氧化剂培养CD34+细胞， 7 d后分离出CD34+细胞， 然后采用SCF/IL6/IL3细胞因子继续培养14 d， 采用SCF/IL6/IL3细胞因子培养的为对照组， 比较总细胞的扩增倍数。结果如图4， 加入抗氧化剂后对CD34+细胞的再扩增能力并没有显著的影响。

　　图4 培养后CD34+细胞的再扩增倍数（略）

　　Fig 4 The fold reexpansion of cultured CD34+ cells (n=4)

　　3 讨论
　　
　　CD34+细胞体外扩增可以有效解决造血干细胞临床应用时所面临的细胞数量不足的问题［7］， 但体外培养环境会对细胞生理功能造成一定的影响， ROS作为细胞内的信号分子能反应培养环境对胞内氧化还原平衡的影响， 调节细胞内ROS水平， 可以减少体外环境导致的细胞氧化应激损伤［8］。
　　
　　我们首先考察了培养过程中CD34+细胞内ROS水平的变化， 发现当培养基中含有细胞因子组合SCF/IL6/IL3时， 细胞内的ROS水平会显著提高， 特别在第7天， 胞内ROS水平达到最高点。李群良等的研究也表明， 培养7 d后的CD34+细胞内抗氧化酶基因高表达［4］。提示使用细胞因子组合体外扩增CD34+细胞可能导致细胞内氧化还原状态发生改变， 使细胞处于过氧化状态。
　　
　　有文献报道， ROS作为一种信号转导物质可刺激某些哺乳动物细胞的增殖［9， 10］。本研究也发现， 在体外培养过程中， 若培养基中不含细胞因子， 扩增获得的CD34+细胞内的ROS水平很低， 与新鲜分离的CD34+细胞相当， 但是细胞并不扩增; 若培养基中同时加入细胞因子和高剂量的抗氧化剂， 尽管可以使扩增获得的CD34+细胞内ROS水平降低到与新鲜分离的CD34+细胞的一致， 但细胞的扩增同样受到抑制， 表明采用细胞因子培养CD34+细胞时， 细胞内ROS水平升高可能是刺激HSPCs体外扩增的前提条件之一， ROS作为信号物质介导了与启动细胞扩增相关的基因NFκB的表达［11］。
　　
　　Ito等［12］在小鼠体内的研究表明， 清除细胞内的ROS可以有效地保持由ATM基因介导的造血干/祖细胞的自我更新能力。Gupta等［13］在小鼠的长期骨髓培养过程中也发现， 使用CAT清除h3O2可保持HSC的自我更新能力， 可见， ROS在CD34+细胞自我更新和分化的平衡中可能扮演着重要的角色， 清除多余的ROS有利于维持造血干/祖细胞功能。
　　
　　研究表明， 使用SOD、 CAT和NAC均能有效地控制细胞体外扩增的过程中胞内的ROS水平， 而且使用低剂量的抗氧化剂适度地清除细胞内的ROS， 扩增后CD34+细胞能更好地保持干/祖细胞特性。目前国内外关于如何适度调控CD34+细胞体外扩增的过程中胞内的ROS水平的报道很少。研究结果为今后优化造血干/祖细胞体外培养条件提供了新的思路。

参考文献

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