【摘要】 目的: 为了用HLAA2.1转基因鼠制备荷瘤模型以评价肿瘤疫苗的免疫效果， 制备共表达HLAA*0201/Kb嵌合基因和MAGE3的B16黑色素瘤细胞。方法: 采用基因共转染的方法， 将HLAA*0201/Kb和MAGE3转染到B16黑色素瘤细胞（B16HLAMAGE3）， 利用RTPCR、 流式细胞术（FCM）和Western blot检测了HLAA*0201/Kb和MAGE3在B16黑色素瘤中的表达; 通过测定CTL活性和体内抑瘤实验证实肿瘤抗原MAGE3可以在B16HLAMAGE3中得到有效加工处理和提呈。结果: RTPCR、 FCM和Western blot检测到HLAA*0201/Kb和MAGE3在B16HLAMAGE3黑色素瘤中的表达; LDH的方法观察到MAGE3疫苗免疫小鼠脾细胞对B16HLAMAGE3细胞的特异性CTL反应， 抑瘤实验也证实， B16HLAMAGE3细胞在免疫小鼠体内生长明显受到抑制。结论: MAGE3基因在B16HLAMAGE3黑色素瘤细胞中得到表达， 并被有效的加工处理、 提呈给特异性CD8+T细胞; B16HLAMAGE3细胞可以用来制备荷瘤模型， 且该方法适合利用转基因小鼠用于人表位疫苗的体内评价。
【关键词】 HLAA2.1转基因鼠 疫苗评价 肿瘤动物模型 基因共转染 MAGE3 pIRES
随着对肿瘤主动免疫疗法研究的不断深入， 人们逐渐认识到CTL反应在肿瘤免疫中发挥着重要作用， 肿瘤抗原CTL表位的研究受到广泛关注， 许多重要的肿瘤抗原如黑色素肿瘤基因（MAGE）家族、 α甲胎蛋白（AFP）及erbB2的CTL表位已被鉴定和识别[1-3]。该工作使肿瘤疫苗的研究尤其是肿瘤表位疫苗的研究得到了迅速的发展。另外， 对肿瘤疫苗的有效评价是肿瘤疫苗研究的一个重要方面。目前， 对人用肿瘤疫苗评价的研究应得益于HLA转基因小鼠的使用[4]， HLAA2转基因小鼠是评价HLAA2限制的表位疫苗的有利工具。但是， 由于缺少表达HLA/H2Kb及人类肿瘤抗原的动物肿瘤细胞株， 对肿瘤疫苗的评价只能通过诱导CTL反应的手段即通过体外实验来进行。而对一种肿瘤疫苗的评价， 仅凭体外实验的结果是不够的， 如对疫苗抑瘤作用机制、 疫苗对肿瘤微环境的影响等方面的评价， 必须通过体内或宿主水平的实验来进行。因此， 为了补充HLAA2转基因小鼠在肿瘤疫苗评价中的作用， 本实验建立了一种既表达HLA/H2Kb嵌合基因， 又表达人的肿瘤抗原MAGE3的小鼠肿瘤细胞株B16HLAMAGE3， 并对该细胞株的特点及功能进行了鉴定。
1 材料和方法
1.1 材料 pcDNAMAGE3和pET32aMAGE3重组表达载体由本室构建; 小鼠黑色素瘤B16细胞株由本室保存; RNA提取试剂RNAex regent及DNA纯化试剂盒购自上海华舜公司; 逆转录试剂盒、 PCR反应混合物、 限制性内切酶Nco I、 Xho I， T4连接酶、 DNA及Mr标准品均为TaKaRa公司产品。质粒抽提为Vgene产品; 真核表达载体pIRES及受体菌TOPO10由本教研室保存。异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）为Solarbio产品。细胞转染试剂 （LIPOFECTAMINE）为Introvigen公司产品; 多肽MAGE3（271279） FLWGPRALV由上海波泰生物科技有限公司合成。LDH检测试剂盒购自德国Roche公司; rIL2购自晶美生物技术公司; MAGE3融合蛋白由本室纯化。HLAA*0201转基因鼠（含有HLAA*0201的α1和α2结构域和H2Kb的α3及胞内区结构域）由上海第二军医大学遗传教研室馈赠（许可证号: SCXKHU20020006）。所有引物均由上海生物工程技术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 HLAA*0201/ Kb嵌合基因和MAGE3的扩增 取HLAA*0201转基因鼠脾脏， 常规抽提总RNA并反转录， 用P1和P2引物扩增HLAA*0201/Kb嵌合基因。P1: 5′CCGCTCGAGATGGCCGTCATGGCGCCCCG3′(引入Xho I酶切位点)， P2: 5′CGACGCGTCTGTCTTCACGCTAGAGAATG3′（引入Mlu I酶切位点）; 根据GenBank人MAGE3基因序列（U03735）设计P3和P4引物: P3: 5′ggaattcaagcctcttgagcagaggagtcag3′（引入EcoR I酶切位点）， P4: 5′acgcgtcgacgtcaatggtgatggtgatgatgactcttccccctctctcaaaacc3′（引入Sal I酶切位点）。以pcDNAMAGE3为模板， 用P3和P4引物扩增MAGE3基因; PCR产物经12 g/L琼脂糖电泳进行鉴定、 DNA胶回收试剂盒回收纯化。
1.2.2 pIRESHLAMAGE3真核表达载体构建 将经胶回收的HLAA*0201/Kb嵌合基因产物和pIRES空质粒分别用Xho I和Mlu I双酶切， T4连接酶连接， 即将HLAA*0201/Kb嵌合基因克隆到载体pIRES的多克隆位点A， 酶切鉴定正确后， 抽提重组载体pIRESHLA/Kb质粒， 用EcoR I和Sal I双酶切割， 同时用该酶处理胶回收的MAGE3的PCR产物， T4连接酶连接， 得到重组表达载体pIRESHLAMAGE3。
1.2.3 HLAA*0201/Kb嵌合基因和MAGE3共转染B16肿瘤细胞 复苏小鼠黑色素瘤B16细胞， 常规培养至对数生长期， 将细胞转移到24孔板， 待细胞密度到90%， 按说明书用LIPOfectin2000脂质体转染试剂将重组质粒pIRESHLAMAGE3和空质粒pIRES分别转染B16细胞， 24 h后用终浓度为1000 mg/ L的G418筛选， 4周后经RTPCR、 细胞流式术（FCM）及Western blot鉴定HLAA*0201/Kb和MAGE3的表达。
1.2.4 动物免疫 动物免疫采用DNA疫苗初免蛋白苗加强的策略。将HLA转基因小鼠分为2组， 每组16只。给实验组小鼠后退肌肉注射用PBS稀释的pcDNAMEGE3质粒（100 μg/只）， 对照组注射相同体积的PBS; 3周后， 重复1次。第2次注射后3周， 于小鼠颈部皮下注射经不完全福氏佐剂乳化的MAGE3融合蛋白（50 μg/只）。
1.2.5 LDH释放法测定CTL活性 按
参考文献
[5]方法， 最后1次免疫后的第10天， 处死小鼠（4只/组）无菌取脾脏， 分离单个核细胞， 调整细胞密度为2×107/L。将细胞转移到24孔板， 0.5 mL/孔。然后将细胞分为3组: （1）加入终浓度为50 mg/L的MAGE3融合蛋白; （2）加入终浓度为50 mg/L的MAGE3271279短肽; （3）加入PBS做为阴性对照。最后加入终浓度20 U的rIL2， 37℃培养7 d作为效应细胞。在培养的第3 天和第5 天半量换液1次。培养时间结束后， PBS洗涤细胞， 调整细胞密度为1×107/L， 将效应细胞加入圆底96孔板， 同时加入不同靶细胞。靶细胞为分别用MAGE3和MAGE3271279肽刺激的T2细胞， pIRESHLAMAGE3和pIRES转染的B16细胞， 共4种。使效应细胞和靶细胞的比例为100∶1和50∶1。然后按照LDH试剂盒说明书进行CTL活性测定。1.2.6 抑瘤实验 在最后1次免疫后的第7天， 将pIRESHLAMAGE3和pIRES转染的B16细胞（106/只）分别移植给免疫小鼠（6只/组）， 然后每天观察肿瘤生长情况。用游标卡尺测量肿瘤直径， 按公式（长径×短径2）/2计算肿瘤块的体积（mm3）。
1.2.7 统计学处理 均采用Student’s t test。
2 结果
2.1 pIRESHLAMAGE3共表达载体的鉴定 pIRES具有2个多克隆位点A和B， 用PCR的方法将HLA/Kb嵌合基因克隆到多克隆位点A， 将MAGE3克隆到多克隆位点B。酶切方法进行鉴定（图1）。经测序2个插入基因片段完全正确。
图1 pIRESHLAMAGE3共表达载体的酶切鉴定（略）
Fig 1 Identification of recombinant of pIRESHLAMAGE3 by restriction endonuclease
1: pIRESHLA and MAGE3 (from top)， digested by EcoR I and Sal I; M: DNA marker; 2: pIRESMAGE3 and HLA/Kb (from top)， digested by Xho I and Mlu I.
2.2 pIRESHLAMAGE3共转染B16 细胞的鉴定 用脂质体方法将重组表达载体pIRESHLAMAGE3和空载体pIRES分别转染B16细胞， 经G418筛选4周， 采用常规RTPCR的方法观察到转染细胞的HLA/Kb和MAGE3的mRNA表达; 采用流式细胞的方法， 用FITC标记的抗HLAA2的抗体检测到HLA的表达; 为了便于Western blot鉴定MAGE3的表达， 克隆MAGE3时， 在下游引物中引入了His标签， 用抗His抗体经Western blot测定了MAGE3的蛋白表达（图2）。
图2 HLA/Kb和MAGE3在共转染B16HLAMAGE3细胞株中的表达（略）
Fig 2 Expression of HLA/Kb and MAGE3 in B16HLAMAGE3 melanoma cells
A: Detection HLA/Kb and MAGE3 mRNA by RTPCR; B: Identification of MAGE3 protein expression by western blot with the antibody of antiHistag; C: Detection of HLAA*0201/H2kb protein in B16HLAMAGE3 melanoma cells by FCM analysis. (Closed histogram， B16HLAMAGE3 cells， Open line histogram， wild B16 cells). 1， 2: HLA/Kb and MAGE3 mRNA expression in wild B16 cells; 3， 4: HLA/Kb and MAGE3 mRNA expression in B16HLAMAGE3 cells， βactin was used as internal control; 5， 6: Wild B16 cells and B16HLAMAGE3 cells.
2.3 免疫小鼠脾细胞对B16HLAMAGE3黑色素瘤细胞的特异性CTL活性测定 为了证实用HLA/Kb和MAGE3共转染的B16细胞株（B16HLAMAGE3）能用于疫苗的评价， 用完整的肿瘤抗原MAGE3或抗原表位肽MAGE3271-279于体外刺激已免疫小鼠的脾细胞， 然后以B16HLAMAGE3为靶细胞观察特异性CTL反应， 用pIRES空质粒转染的B16细胞（B16pIRES）和抗原表位肽MAGE3271-279负载的T2细胞为阴性和阳性对照。实验结果可见， 免疫小鼠脾细胞在体外用肿瘤抗原或抗原肽刺激后， 可有效杀伤B16HLAMAGE3黑色素瘤细胞， 在效靶比例为100∶1时， 杀伤率高达47%; 而对B16pIRES肿瘤细胞的杀伤率只有8%， 二者有统计学意义（P&<0.05， 图3）。
图3 免疫小鼠脾细胞对B16HLAMAGE3细胞的CTL活性测定（略）
Fig 3 Detection of CTL activity of immunized mice splenocytes against B16HLAMAGE3 target cells
2.4 免疫小鼠对B16HLAMAGE3移植肿瘤的生长抑制作用 为进一步证实黑色素瘤细胞株B16HLAMAGE3的成瘤性以及可用于制备荷瘤模型， 本实验中将体外培养至对数生长期的B16HLAMAGE3和B16pIRES分别移植到免疫过的HLA转基因小鼠（106/只）。肿瘤移植后的第5天， 阴性对照组可触及到肿瘤块生长。从荷瘤的第5天， 每天用游标卡尺测量瘤块大小， 得到肿瘤生长曲线图（图4A）。从图可见， B16HLAMAGE3移植小鼠， 从荷瘤第10天， 除实验组有一只小鼠肿瘤停止生长外， 实验组小鼠肿瘤生长明显缓慢， 与阴性对照组比有统计学意义（P&<0.01）; 在小鼠荷瘤的第25天， 将小鼠全部处死， 测量肿瘤大小（图4B）， 可知实验组的6只小鼠肿瘤块均明显小于3个对照组（P&<0.01）。
图4 免疫小鼠对B16HLAMAGE3黑色素瘤的生长抑制作用（略）
Fig 4 B16HLAMAGE3 growth inhibited in immunized mice
A: Tumor growth curve in immunized mice; B: Tumor volumes in immunized mice on day 25 after tumor challenge (bP&<0.01 vs other groups).
3 讨论
HLA转基因鼠是评价HLA限制的CTL表位疫苗的一种有利工具[4]， 因HLAA*0201等位基因频率在高加索人和亚洲人中占50%左右[6]， 因此在所有HLA转基因鼠中， HLAA*0201转基因小鼠是使用率最高的一种。用HLAA*0201转基因鼠来评价疫苗的优势在于， 可通过测定CTL反应为指标， 观察疫苗的制备工艺、 注射剂量、 注射途径及疫苗剂型等。
为了扩大转基因鼠在疫苗评价中的作用， 有人利用HLAA*0201/Kb转基因鼠制备荷瘤模型[7， 8]， 而合适的荷瘤动物模型也是评价肿瘤疫苗不可或缺的工具。根据组织相容性原理， 利用HLAA*0201转基因小鼠制备肿瘤模型， 肿瘤细胞必须表达HLAA*0201和肿瘤抗原分子。Mullins等[7]将HLAA*0201/Kb嵌合基因转染B16黑色素肿瘤细胞， 得到表达HLAA*0201/Kb的B16AAD细胞， 同时， 该细胞自身高表达糖蛋白gp100和tyrosinase(酪氨酸酶)， 利用HLA转基因鼠和B16ADD细胞株， 成功地制备了肿瘤动物模型并对来源于gp100和tyrosinase的表位疫苗进行了评价。另外， Machlenkin等[8]将HLAA*0201和前列腺酸性磷酸酶（PAP） 2个全长基因转染3LL Lewis肺癌， 也成功地利用荷瘤模型对PAP疫苗进行了评价。
本实验中所使用的小鼠为HLAA*0201/Kb转基因鼠， 因此， 要求所用肿瘤细胞是起源于C57BL/6小鼠， 同时还要表达HLAA*0201/Kb嵌合基因和肿瘤抗原MAGE3。实际上， 使肿瘤细胞表达HLAA*0201/Kb嵌合基因比表达HLAA*0201全长基因更能真实地反映疫苗的免疫效果， 因为嵌合基因中鼠源的α3功能区是通过与T细胞的CD8分子结合而活化T细胞的重要因素[9]。因此， 为了实现上述目的， 在本实验中， 我们采用能表达2个目的基因的pIRES真核表达载体[10]， 将HLAA*0201/Kb嵌合基因和肿瘤抗原MAGE3分别克隆在该表达载体的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site， IRES）两侧的克隆位点A和B（图1）; 然后通过细胞转染的方法使HLAA*0201/Kb嵌合基因和MAGE3在B16黑色素瘤细胞中获得表达（图2）。通过CTL反应的体外实验（图3）及荷瘤模型的体内实验（图4）均证实， B16HLAMAGE3黑色素瘤细胞可以加工处理MAGE3肿瘤抗原， 并能够较好地将抗原肽提呈给CD8+T细胞。结果表明， 该瘤细胞可用于MAGE3疫苗在HLA*0201转基因小鼠的体内评价。
总之， 本实验成功地制备了可表达HLAA*0201/Kb嵌合基因和肿瘤抗原的MAGE3的黑色素瘤细胞株， 本实验的意义不仅在于为评价人用MAGE3肿瘤疫苗提供了一种细胞株， 而且为其他人用疫苗的免疫评价提供了可参考的方法。
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