新疆家蚕抗菌肽的抗体制备及鉴定

【摘要】 目的: 制备鼠抗新疆家蚕抗菌肽（CecropinXJ）的抗体， 用于抗菌肽的体外细胞定位分析。方法: 将编码抗菌肽的cDNA序列亚克隆到真核表达载体pcDNA3上， 构建重组真核表达载体pcDNA3/CecropinXJ， 进行核酸免疫昆明白小鼠; 同时构建原核表达载体， 对抗菌肽进行融合表达， 以表达的融合蛋白作为检测抗原。采用免疫电镜技术分析CecropinXJ的作用部位。结果: 间接ELISA表明， 重组质粒第5次免疫的效价最高; 免疫胶体金实验显示， 所制备的抗血清能够对抗菌肽作用部位进行准确清晰的定位。结论: 所制备的鼠抗CecropinXJ的抗血清具有较高的免疫反应性和特异性， 为CecropinXJ的抑菌机制研究提供了有力的工具， 同时也为小分子肽抗体的制备提供了参考。

【关键词】 新疆家蚕抗菌肽 核酸免疫 小分子肽 抗体制备

　　新疆家蚕抗菌肽（CecropinXJ）是一种含有37个氨基酸小分子抗菌肽， 所编码的蛋白氨基酸序列与已报道的家蚕Bombyx mori抗菌肽B序列同源性达到了98%［1］。一般认为抗菌肽通过破坏细菌细胞膜而作用的， 其分子带正电荷， 在静电作用下与带负电的细菌细胞表面结合， 疏水的C端插入细菌细胞膜中的疏水区域， 随着抗菌肽分子在细菌细胞膜上的聚集， 使得膜外正电荷增多， 两侧膜电位升高， 最终改变了细胞膜的构象， 多个抗菌肽分子聚合在细菌细胞膜上形成离子通道， 造成细菌细胞内物质泄漏和细菌死亡［2］。CecropinXJ的抑菌机制尚不清楚， 本研究采用核酸初次免疫， 核酸加强的方法［3， 4］制备了小分子肽CecropinXJ的抗体， 为研究其抑菌机制提供了重要的工具。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 大肠杆菌BL21、 DH5α、 真核表达载体pcDNA3和原核表达载体pET30a为新疆生物资源基因工程重点实验室保存; pGEX4T1CecropinXJ、 pGAPZαCecropinXJ为新疆生物资源基因工程重点实验室已构建好的质粒， 用于免疫胶体金实验的抗菌肽（5 mg/L）为新疆生物资源基因工程重点实验室通过酵母表达、 纯化获得。DNA片段回收试剂盒、 T4 DNA连接酶及各种限制性内切酶均为TaKaRa公司产品。低分子量标准蛋白为北京天根公司产品。IPTG、 TMB购自华美生物工程公司。HRP标记羊抗鼠IgG、 金标羊抗鼠IgG、 凝胶回收试剂盒均购自北京博奥森生物公司。昆明白小鼠购自新疆医科大学动物实验中心。其他化学试剂均为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 重组表达载体的构建 将CecropinXJ基因分别构建到pcDNA3真核表达载体和pET30a原核表达载体上。用Not I和EcoR I分别酶切pGAPZαCecropinXJ， pcDNA3和pET30a。用凝胶回收试剂盒分别回收405 bp左右的片段， 5 400 bp（pcDNA3）和5 400 bp（pET30a）左右的片段。于16℃连接过夜。重组质粒命名为pcDNA3CecropinXJ和pET30aCecropinXJ。将pcDNA3CecropinXJ转化大肠杆菌DH5α， pET30aCecropinXJ则转化BL21（DE3）， 37℃过夜培养。挑取阳性菌落， 提取质粒， 进行酶切、 测序鉴定。

　　1.2.2 CecropinXJ的原核表达 将pET30acecropinXJ和pET30a分别转化大肠杆菌BL21， 挑取单个转化菌落接入2 mL LB（pET30a为卡那霉素抗性， 按2 g/L加卡那霉素）液体培养基中， 37℃震荡培养过夜后按1%接种至新配置的含有相同浓度的卡那霉素的LB液体培养液中， 震荡培养至A600达到0.6， 加IPTG至终浓度为0.5 mmol/L， 继续诱导3 h， 不加IPTG诱导为对照。诱导结束后， 取菌液各1.5 mL， 于4℃， 12 000 r/min离心收集菌体。沉淀用40 μL PBS重悬。再加入等体积的SDS凝胶加样缓冲液混匀后， 沸水浴10 min， 12 000 r/min离心10 min， 取上清进行120 g/L SDSPAGE检测。经鉴定为包涵体。将细菌裂解物沉淀按下列步骤对包涵体进行洗涤: 包涵体洗涤液Ⅰ（TrisCl 50 mmol/L， pH8.0; NaCl 100 mmol/L; EDTA 10 mmol/L， pH8.0; TritonX100， 10 mL/L）作用1 h， 包涵体洗涤液Ⅱ（TrisCl 50 mmol/L， pH8.0; NaCl 100 mmol/L; EDTA 10 mmol/L， pH8.0; TritonX100， 0.5%）作用1 h， 溶液Ⅲ（TrisCl 50 mmol/L， pH8.0; EDTA 10 mmol/L， pH8.0; 尿素2 mL/L; 脱氧胆酸钠， 2 g/L; 二硫苏糖醇， 0.5 mmol/L）作用48 h。 取洗涤液做SDSPAGE， -20℃保存， 作为ELISA 包被抗原。

　　1.2.3 重组质粒pcDNA3cecropinXJ的大量制备及纯化 按照萨姆布鲁克的分子克隆手册大量制备质粒DNA的方法， 大量提取质粒pcDNA3CecropinXJ， 以130 g/L PEG8000和1.6 mol/L NaCl（等体积）纯化质粒， 用HITACHI UV3010紫外分光光度计检测质粒DNA的浓度， 并用灭菌生理盐水稀释至1 g/L。

　　1.2.4 鼠抗CecropinXJ抗血清的制备 选取4～6周昆明白雌性小鼠， 随机分pcDNA3CecropinXJ， pcDNA3两组， 各5只， 于小鼠左后腿胫骨前肌纵向3点注射100 μL 5 mL/L盐酸普鲁卡因， 24 h以内在同一部位用生理盐水处理好的质粒pcDNA3CecropinXJ， pcDNA3免疫昆明白小鼠， 100 μg/只， 分别于两星期后用相应的质粒加强免疫， 共免疫6次。每次免疫前1 d于小鼠眼后底眶取血， 收集血清。

　　1.2.5 Western blot 将纯化的包涵体和相应蛋白诱导后的全菌蛋白进行SDSPAGE， 在Marker左右分别各跑一泳道， 将含有Marker泳道的凝胶切下做考马斯亮蓝染色， 另一半凝胶进行湿转至硝酸纤维素膜（150 mA， 1 h）。 加入核酸免疫的鼠抗cecropinXJ血清（1∶100）， 室温在摇床上轻微摇荡2 h， TBST洗涤3次， 每次5 min， 二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG， 稀释倍数1∶1 000（厂家推荐）， 室温在摇床上轻微摇荡1 h， TBST洗涤3次， 每次5 min， 最后DAB显色。用Alpha凝胶成像仪拍照。

　　1.2.6 鼠抗CecropinXJ抗血清的ELISA检测 为了确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数， 采用方阵滴定法来确定， 采用间接ELISA法检测抗体效价。将融合蛋白用Bradford方法进行定量。参照文献［5］ 融合蛋白按1∶200， 1∶300， 1∶400， 1∶500共4个梯度稀释， 每孔加100 μL， 包被96孔酶标板， 阳性血清和阴性血清都按1∶50稀释， HRP标记的羊抗鼠IgG按1∶2 000稀释， TMB显色， 用2 mol/L的h3SO4终止反应， 测A450值， 选择阴性A450值小于0.1， P/N值最大时的抗原包被浓度为最佳的工作浓度。以包涵体蛋白6×HisCecropinXJ最佳的工作浓度包被ELISA板， 4℃过夜。弃去孔内液体， 用洗涤液（PBST， 含0.5 g/L Tween20）洗涤3次， 每次3 min。每孔加入100 μL按一定等比稀释的抗CecropinXJ的抗血清（1∶50稀释）， 37℃温浴2 h。洗涤（方法同上）后， 加入100 μL（1∶2 000稀释）稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG， 37℃温浴1 h。洗涤（方法同上）后， 加入100 μL TMB显色液， 37℃温浴20 min。然后加入50 μL 2 mol/L h3SO4终止反应液， 读取A450/655值。数据用Excel 2003处理。

　　1.2.7 免疫胶体金实验 抗血清按1∶50稀释， 金标二抗按1∶100 稀释。操作步骤参照文献［6］， 按1%的接种量， 培养金黄色葡萄球菌（S.aureus）至对数生长期， 3 000 r/min 离心5 min， 沉淀菌体用0.1 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液稀释为1×109 CFU/L。取3份5 mL菌液， 各加入100 μL抗菌肽（5 mg/L）， 37℃培养3 h。12 000 r/min离心5 min后， 用2 mL/L的戊二醛固定菌体细胞2～4 h， 再用锇酸处理1.5～2 h， 磷酸盐缓冲液洗涤， 乙醇梯度脱水及丙酮置换30 min， 环氧树脂包埋， 超薄切片后置于铜网上烘干。然后滴加抗体， 阳性血清和阴性血清均按1∶50稀释， 金标二抗按1∶100稀释。用醋酸铀染色20 min， 柠檬酸铅染色20 min， 待镜检。

　　2 结果

　　2.1 重组表达载体的构建 利用EcoR I+Not I对重组质粒pcDNA3CecropinXJ和pET30aCecropinXJ进行双酶切和测序鉴定， 结果表明CecropinXJ片段正确的插入到pcDNA3和pET30a的多克隆位点（图1）。

　　图1 重组质粒的酶切鉴定（略）

　　Fig 1 Restriction enzyme digestion of recombinant plasmid

　　M: DNA marker; 1: pcDNA3CecropinXJ/EcoR I+Not I; 2: pET30aCecropinXJ/EcoR I+Not I.

　　2.2 CecropinXJ基因的原核表达 将鉴定正确的重组pET30aCecropinXJ转化大肠杆菌BL21， 诱导表达后， 收集表达菌经超声破碎后， 分别取上清和沉淀进行SDSPAGE分析。结果表明， 在相对分子质量（Mr）为17 000左右处有1条明显的融合蛋白条带（图2A）， 目的蛋白以包涵体的形式存在。经包涵体洗涤处理， 最终获得2条纯度较高的蛋白条带（图2B）， Mr 17 000左右的条带为目的蛋白。融合蛋白比预期蛋白Mr大， 主要是融合了载体序列和CecropinXJ基因编码框前部分序列所致。

　　图2 重组质粒pET30acecropinXJ在BL21中表达和包涵体的处理（略）

　　Fig 2 Expression of recombinant plasmid in E.coli BL21 and Dilution of inclusion body

　　A: Expression of recombinant plasmid in E.coli BL21. 1， 2: pET30a/CecropinXJ(induction with IPTG); 3: pET30a/CecropinXJ(without induction); 4: Protein marker; 5: pET30a（induction with IPTG）; 6: pET30a (without induction). B: 1: Protein marker; 2: The Western blot of the 6HiscecropinXJ; 3: Fusion protein washed.

　　2.3 Western blot 用所制备的鼠抗cecropinXJ血清按1∶100倍稀释， 以Western blot检测抗体的特异性， 结果见图2B。 与相应蛋白诱导后的全菌蛋白进行反应时， 在Mr约为17 000处， 有明显的显色印迹， 但同时也有少量的非特异性带。说明用pcDNA3cecropinXJ免疫动物产生的抗血清具有较好的特异性， 能特异的识别相关的CecropinXJ蛋白。

　　2.4 鼠抗CecropinXJ抗血清的ELISA检测结果 间接ELISA方阵滴定法确定了最佳抗原稀释倍数（表1）， 方阵实验结果表明抗原的最佳稀释倍数为1∶300， 含量为0.6 μg/孔， 血清稀释倍数为1∶50时， P/N=35最大。（阳性血清A450/阴性血清A450&>2.1， 阳性血清A450&>1， 阴性血清A450&<0.1）。间接ELISA检测各次免疫后抗血清1∶50稀释时A450值， 如图3所示第5次加强免疫后效果最佳。

　　表1 间接ELISA方阵滴定确定最佳的抗原稀释倍数（略）

　　Tab 1 The results of the indirect ELISA phalanx titrimetry

　　图3 间接ELISA检测结果（略）

　　Fig 3 The results of indirect ELISA

　　2.4 免疫胶体金试验 在ELISA检测的基础上， 选择第5次免疫的抗血清进行免疫胶体金试验（图4）。结果表明， CecropinXJ和金黄色葡萄球菌作用了3 h时， 胶体金颗粒分布在金黄色葡萄球菌细胞膜的周围并且细胞膜的周围呈现明亮状态; 对照组: 细胞膜的周围呈现明亮状态， 但未呈现出胶体金颗粒。未经处理的金黄色葡萄球菌细胞则保持完好的形态。

　　图4 免疫胶体金标记的透射电镜观察结果（略）

　　Fig 4 The results of immunolabelled by goldconjugated goat antimouse IgG using transmission electron microscopy

　　A: S.aureus（without treatment）; B: S.aureus was treated with CecropinXJ (using mouse antipcDNA3 serum); C: S.aureus was treated with CecropinXJ (using mouse antipcDNA3/cecropinXJ serum).

　　3 讨论
　　
　　一般来讲， 小分子肽基因常采用融合表达的方法来获得靶蛋白来提高免疫原性， 然后免疫动物来制备相应的抗血清， 并且融合蛋白易于切割， 回收与纯化［7］。CecropinXJ是一种小分子肽（含信号肽的编码序列为189 bp， 核心编码序列为111 bp）， 本身具有抗菌活性， 对宿主菌有杀伤作用。本实验室已经构建了pGEX4T1CecropinXJ（含有信号肽序列）融合表达载体， 并且体内抑菌实验表明， 所表达的融合蛋白（未切标签GST）可以抑制宿主菌的生长， 导致利用细菌表达的融合蛋白量低， 难以获得足量的抗原。虽然家蚕抗菌肽融合蛋白以包涵体形式表达， 但通过Western blot所显示的微弱的条带可以看出包涵体具有抗原性， 可以与抗血清发生特异性的反应。因而对于重组质粒pET30aCecropinXJ所诱导的融合蛋白6×HisCecropinXJ， 经过120 g/L的SDSPAGE 鉴定也为包涵体。通过包涵体的洗涤处理， 最终只剩2条带， 表明纯度较高。随后， 用少量的盐酸胍溶解后， 用PBS（pH7.4）稀释溶解融合蛋白用作检测抗原。为了确定抗原最佳包被浓度， 对6HisCecropinXJ包涵体蛋白用方阵滴定来确定其最佳的包被浓度为0.6 mg/L。因此选用溶解洗涤后的包涵体蛋白为ELISA方法的包被抗原。间接ELISA结果显示， 在6次免疫中， 第5次核酸加强免疫的A450值最高， 第6次核酸加强免疫后A450值降低， 可能是小鼠对抗原产生了免疫耐受而造成的［8］。对鼠抗CecropinXJ血清进行检测， 包涵体包被抗原所显示的A450较高， 而且在1∶50稀释度下均保持在1.9左右， 可能与免疫原基因片段含有信号肽序列（分泌型抗原基因）有关［9］。对于第2次核酸加强免疫和第3次核酸加强免疫对照组的A450值比实验组的高， 其原因尚不清楚还待进一步的探讨。溶解洗涤后的包涵体主要为变性蛋白， 几乎没有生物学活性， 但是并不影响其作为ELISA检测用的包被抗原［10］。本实验直接将编码抗菌肽的基因片段（分泌型）亚克隆于真核表达载体质粒pcDNA3上， 以重组质粒为免疫原对小鼠进行肌肉注射， 激发小鼠的体液免疫， 使小鼠产生抗CecropinXJ的抗血清从而对不同标签的融合蛋白（GST和6×His的）产生阳性反应。本实验省略了常规实验中对包涵体的复性后过柱纯化等烦琐步骤， 结果显示其不影响作为检测抗原的效果， 且方便大量制备。其最大的优点是: 简单， 省时。
　　
　　本研究中， 我们采用免疫胶体金实验以观察CecropinXJ在细菌细胞上的定位。电镜结果显示: CecropinXJ和金黄色葡萄球菌作用了3 h时， 胶体金颗粒分布在金黄色葡萄球菌细胞膜的周围， 且细胞膜的周围呈现明亮状态; 对照组: 细胞膜的周围呈现明亮状态， 但未呈现出胶体金颗粒; 未经处理的金黄色葡萄球菌细胞则保持完好的形态。推测， 新疆家蚕抗菌肽CecropinXJ作用于细菌的细胞膜， 造成了细菌细胞内含物的泄漏， 细胞膜萎缩， 与金黄色葡萄球菌坚硬的细胞壁分离， 造成了在透射电镜下细胞膜周围明亮的现象。结果表明， 新疆家蚕抗菌肽作用于细菌细胞膜， 可能与经典的抗菌肽作用机制即离子通道学说［2］相符。本研究中制备的鼠抗CecropinXJ抗体不仅可用于检测CecropinXJ在细胞中的定位， 为探讨其抑菌机制奠定了基础， 同时为小分子肽抗体的制备提供了一个可行的方法。

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