选择性环氧合酶2抑制剂NS398对肝星状细胞凋亡的影响

【摘要】 目的: 观察选择性环氧合酶2抑制剂NS398对肝星状细胞（HSC）凋亡及凋亡相关基因的影响。方法: 采用不同浓度的NS398作用于HSCT6， 应用流式细胞术和透射电镜检测HSC凋亡， 细胞免疫化学法检测凋亡HSC中凋亡相关基因p53、 bcl2蛋白表达的变化。结果: 90、 120、 150 μmol/L NS398作用HSCT648 h后， 流式细胞术检测到HSC凋亡， 各组凋亡指数分别为（10.5±0.015）%、 （13.2±0.010）%和（17.3±0.012）%， 与对照组(4.3±0.006)%比较， 差异有统计学意义（P&<0.01）; 透射电镜观察到细胞皱缩、 核染色质浓缩沿核膜排列等细胞凋亡特征性改变; 以120 μmol/L NS398作用HSCT648 h后， 凋亡相关蛋白p53、 bcl2的阳性细胞百分率分别为（82.06±0.14）%、 （34.20±0.77）%， 与对照组（14.06±0.24）%、 （96.66±0.79）%比较， 差异有统计学意义（P&<0.01）。结论: NS398可以剂量依赖性诱导HSC凋亡; 上调凋亡相关基因p53的表达， 下调bcl2的表达可能是NS398诱导HSC凋亡的机制之一。

【关键词】 环氧合酶2 NS398 肝星状细胞 细胞凋亡

　　肝星状细胞( hepatic stellate cell， HSC) 在肝纤维化的发生发展中具有重要作用， HSC增殖与凋亡的失平衡是肝纤维化发生发展的主要细胞生物学基础， 在肝纤维化的发生发展中起重要作用， 诱导其凋亡是治疗肝纤维化的重要策略。有观察显示HSC中有选择性环氧合酶2（cyclooxgenase2， COX2）基因的表达， 而且其表达与HSC的增殖有关［1］。我们前期的研究已证实选择性环氧合酶2抑制剂NS398可以确切地抑制HSC增殖［2］。本实验拟进一步观察NS398诱导HSC凋亡的作用及其可能的分子机制， 以探索临床抗肝纤维化的新途径。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 肝星状细胞系（HSCT6）， 由上海中医药大学徐列明教授提供， 系SV40转染的大鼠HSC， 具有活化HSC的表型; NS398为美国Cayman公司产品; DMEM培养液、 新生牛血清分别购自美国Gibco及Hyclone公司; AnnexinⅤFITC及PI购自美国罗氏公司; 小鼠抗大鼠bcl2单克隆抗体(mAb)购自美国Santa Cruz公司; 兔抗大鼠野生型p53多克隆抗体购自武汉博士德公司; 即用型第2代免疫组化EliVisionplus广谱试剂盒和DAB显色试剂盒购自福建迈新生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 NS398贮存液的配制 以少量DMSO溶解， 加入无血清DMEM配制成800 μmol/L的贮存液， 0.22 μm微孔滤器过滤除菌， 分装， 避光存于-20℃保存， 2周内有效。使用时用含20 mL/L血清的DMEM培养液稀释至所需的药物浓度， DMSO的终浓度要求低于1‰， 细胞对照组加入相同浓度的DMSO， 以排除DMSO对细胞生长的影响。

　　1.2.2 HSCT6的培养与传代 采用含100 U/mL青霉素、 100 U/mL链霉素、 100 mL/L新生牛血清的DMEM培养液， 在37℃、 50 mL/L CO2及饱和湿度下培养， 隔日换培养液， 待细胞生长至80%～90%密度时， 用0.2 g/L EDTA和2.5 g/L胰蛋白酶消化， 按1∶4比例传代。

　　1.2.3 药物细胞毒性试验 倒置显微镜下观察HSCT6形态。NS398对HSCT6的细胞毒性:取对数生长期细胞， 调整细胞密度为7.5×107/L， 细胞接种于96孔培养板中， 每孔200 μL， 24 h后弃上清， 加入含不同浓度的NS398（0、 5、 20、 40、 80、 120、 160、 240、 320 μmol/L）培养液， 每孔200 μL， 每组设4个复孔， 培养48 h后， 收集培养液上清， 全自动生化分析仪检测上清中LDH水平。

　　1.2.4 细胞凋亡检测 流式细胞术检测: 取对数生长期细胞， 以1.2×106/瓶的密度接种于T25培养瓶中， 24 h后加入各浓度NS398（0、 90、 120、 150 μmol/L）培养48 h， 收集所有细胞， 取1×106洗涤细胞， 加100 μL结合缓冲液， 并加AnnexinVFITC染液和碘化丙啶（PI）染液各2 μL， 室温避光染色30 min， 再加结合缓冲液300 μL， 以流式细胞术检测HSC凋亡， AnnexinVFITC+/PI-为凋亡细胞， 计算各组细胞的凋亡百分率。细胞凋亡的形态学观察: 取对数生长期细胞， 以1.2×106/瓶的密度接种于T25培养瓶中， 24 h后选取凋亡率较高的150 μmol/L NS398作为实验浓度作用48 h， 收集悬浮与贴壁的细胞， PBS 洗涤1次， 25 g/L戊二醛4℃固定1 h， 10 g/L锇酸后固定30 min， 常规包埋，超薄切片， 日立h360透射电镜观察。

　　1.2.5 免疫细胞化学检测 取对数生长期细胞， 以5×108/L密度滴加于提前处理好的置于6孔板内的盖玻片上， 培养24 h 后， 选取凋亡率较高的150 μmol/L NS398作为实验浓度作用于培养细胞， 同时设不加NS398的对照组， 再培养48 h 后以40 g/L多聚甲醛固定细胞， 分别使用p53、 bcl2一抗， 用两步法进行细胞免疫化学染色， 采用DAB显色， 苏木素复染。于光学显微镜视野下计数阳性细胞数比例， 每张切片计数10个视野， 以阳性细胞百分数代表各种蛋白表达阳性率。

　　1.2.6 统计学分析 数据采用Mean±sD表示， 使用SPSS11.5统计软件， 多组数据间的比较采用单因素方差分析或独立样本t检验， P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 药物的细胞毒性作用 倒置显微镜下各组细胞生长良好， 细胞形态正常， 核膜完整， 无细胞脱失区， 无细胞碎片。血清LDH水平检测显示: NS398在20～160 μmol/L浓度范围内， 培养液上清中的LDH水平与空白对照组相比较无明显增加（P&>0.05）， 提示当NS398≤160 μmol/L时， 对HSC无毒性作用; NS398在240～320 μmol/L浓度范围内， 培养液上清中的LDH水平与空白对照组相比较明显增加（P&<0.05）， 显示对HSC 有一定的毒性作用。

　　2.2 细胞凋亡检测 流式细胞术检测细胞凋亡NS398作用48 h可明显诱导HSCT6发生凋亡， 细胞凋亡率与药物浓度正相关。90、 120、 150 μmol/L的NS398作用48 h后HSCT6的细胞凋亡率分别为（10.5±0.015）%、 （13.2±0.010）%和（17.3±0.012）%， 与对照组(4.3±0.006)%比较差异具有统计学意义（P&<0.01）。细胞凋亡的形态学观察显示NS398120 μmol/L作用48 h后， 透射电镜观察到细胞皱缩， 凋亡细胞体积较正常细胞变小， 核染色质浓缩， 沿核膜排列， 细胞器也发生浓缩（图1）。

　　图1 NS398诱导肝星状细胞凋亡的透射电镜观察（略）

　　A: 正常肝星状细胞 （×3500）; B: 与正常细胞对比， 凋亡细胞体积明显缩小， 核体积也缩小（×4000）; C: 染色质浓集并沿核膜排列， 呈新月体状 （×4000）; D: 核体积进一步缩小， 裂解为多个致密体（×6000）.
　　　　　　　　
　　2.3 免疫细胞化学实验 120 μmol/L NS398处理HSCT6后， 凋亡相关蛋白p53、 bcl2的阳性细胞百分率分别为（82.06±0.20）%、 （34.20±0.77）%， 与对照组（14.06±0.24）%、 （96.66±0.79）%比较， 差异有统计学意义（P&<0.01）。

　　2.3.1 p53蛋白的表达 细胞爬片p53蛋白免疫组化染色显示正常对照片中仅有少量细胞在细胞核中表达p53蛋白， 表现为胞核有棕黄色颗粒沉积， 细胞质及细胞膜无阳性染色; 而120 μmol/L NS398处理的细胞中大量细胞的细胞核着色， 阴性对照片中无阳性着色部位（图2）。

　　图2 p53细胞免疫化学染色结果（×400）（略）

　　A: 对照组; B: NS398组.

　　2.3.2 bcl2蛋白的表达 细胞爬片bcl2蛋白免疫组化染色于正常对照片中见绝大部分细胞在细胞膜和细胞质中表达bcl2 蛋白， 表现为棕黄色颗粒沉积于细胞表面及内部; 120 μmol/L 处理的细胞中阳性染色细胞的数目明显减少， 阴性对照片中无任何阳性着色部位（图3）。

　　图3 Bcl2细胞免疫化学染色结果（×400）（略）

　　A: 对照组; B: NS398组.

　　3 讨论
　　
　　环氧合酶2（cyclooxygenase2， COX2）是体内将花生四烯酸代谢为前列腺素类衍生物的关键酶， 研究证明其具有致有丝分裂作用［3］。NS398是一种磺胺类药剂的衍生物， 是非甾体类抗炎药物之一， 属COX2选择性抑制剂，能特异性地抑制COX2。在离体情况下， 3 μmol/L NS398 就可使COX2 的活性降低， 当其浓度达100 μmol/L 时， COX2的活性可被完全抑制。
　　
　　有研究显示NS398可以抑制HSC的活化、 增殖［4］， 我们既往的研究也发现NS398可以明显抑制HSC的增殖， 使其发生G2/M期阻滞［2］。本实验进一步观察NS398诱导HSC凋亡的作用， 并探讨其可能的作用机制。结果表明在(20～160) μmol/ L浓度范围内， NS398对HSC无细胞毒性作用， 能诱导HSC的凋亡， 且HSC凋亡率随药物浓度的增加而增高; 免疫细胞化学结果显示NS398组p53蛋白表达上调， 而bcl2蛋白表达下调。
　　
　　大量研究表明凋亡相关基因bcl2和p53参与了HSC的凋亡。Sail等发现在静止的HSC中未检测到bcl2和p53的表达， 在培养的第4天和第7天（HSC被激活）表达量增加， p53启动HSC凋亡， 而bcl2延迟p53的这种作用［5］。但是NS398诱导HSC凋亡的分子机制目前研究较少， 现有的研究结果多是在COX2抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究中得出的。众多研究证明， Bcl2 在细胞凋亡调控途径中处于COX2的下游位置。孙波等［6］研究发现， 经舒林酸作用后肝癌细胞内COX2 和Bcl2蛋白表达减少， 提示舒林酸通过抑制COX2进而抑制Bcl2的表达， 从而诱导肝癌细胞产生凋亡。动物实验中也发现， COX2表达的增加促使大鼠肠道表皮细胞Bcl2蛋白表达增加， 使细胞凋亡减弱［7］。李志刚等［8］研究也发现NS398可抑制子宫内膜细胞增殖， 细胞凋亡增多， 而使用外源性PGE2可逆转NS398对子宫内膜细胞的抑制作用， 使COX2生成增多， 凋亡抑制蛋白Bcl2的产生逐渐增多， 并且存在着浓度与时间效应， 细胞增殖重新活跃， 细胞凋亡率减少。

　　本研究进一步明确NS398可以诱导HSC凋亡， 且与p53蛋白表达上调， bcl2蛋白表达下调相关， 可能为NS398诱导HSC凋亡的机制之一， 为寻找新的抗肝纤维化的药物和途径进行了有益探索。但NS398通过何种途径影响HSC的p53、 bcl2的表达， 其具体的机制尚不清楚， 是否还通过其他信号传导途径诱导HSC的凋亡、 或通过对凋亡调控基因的调节而影响HSC的凋亡， 尚有待于进一步研究。

参考文献

　　［1］ Li D， Friedman SL. Liver fibrogenesis and the role of hepatic stellatecells: new insights and prospects for therapy［J］. J Gastroenterol Hepato， 1999， 14(7): 618-633.

　　［2］ 舒建昌， 潘 洁， 沈 雁， 等. 环氧合酶2抑制剂联用姜黄素对肝星状细胞增殖抑制作用的观察［J］. 广东医学， 2006， 27（8）: 32-34.

　　［3］ Sheng GG， Shao J， Sheng H， et al. A selective cyclooxygenase2 inhibitor suppresses the growth of Hrastransformed rat intestinal epithelial cells［J］. Gastroenterology， 1997， 113(6): 1883-1889.

　　［4］ Cheng J， Imanishi H， Liu W， et al. Inhibition of the expression of alphasmooth muscle actin in human hepatic stellate cell line， LI90， by a selective cyclooxygenase2 inhibitor， NS398［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2002， 297(5): 1128-1134.

　　［5］ Saile B， Knittel T， Matthes N， et al. CD95/CD95Lmediated apoptosis of the hepatic stellate cell. A mechanism terminating uncontroll hepatic stellate cell proliferation during hepatic tissue repair［J］. Am J Pathol， 1997， 151（5）: 1265-1272.

　　［6］ 孙 波， 吴云林， 王升年， 等. 舒林酸诱导人肝细胞癌凋亡及对环氧合酶2和Bcl2蛋白表达的影响［J］. 中华消化杂志， 2002， 22(6): 338-340.

　　［7］ Sheng H， Shao J， Morrow JD， et al. Modulation of apoptosis and Bcl2 expression by prostaglandin E2 in human colon cancer cells［J］. Cancer Res， 1998， 58: 362-366.

　　［8］ 李志刚， 郎景和， 冷金花. NS398与前列腺素E2对子宫内膜异位症子宫内膜细胞环氧合酶2 mRNA 表达与凋亡的影响［J］. 现代妇产科进展， 2005， 14（1）: 30-33.