PPARγ对人胰腺癌细胞中抑癌基因PTEN表达的影响

【摘要】 目的: 观察PPARγ对人胰腺癌细胞中抑癌基因PTEN表达的影响。方法: 体外培养人胰腺癌细胞株PANC1， 使用罗格列酮和GW9662细胞分别处理PANC1细胞， RTPCR检测PANC1细胞中PTEN基因表达的变化; SABC法检测PTEN蛋白表达的变化， FCM法检测PTEN蛋白表达的百分率的变化。结果: PPARγ激动剂罗格列酮能够诱导抑癌基因PTEN的高表达， 同时抑制剂GW9662能够抑制抑癌基因PTEN的表达， 并呈一定的量效关系。结论: 胰腺癌细胞中PPARγ的表达与抑癌基因PTEN的表达呈一定的平行关系， PPARγ可能通过一定信号转导通路调节抑癌基因PTEN的表达， 从而发挥抗肿瘤的作用。

【关键词】 PPARγ 胰腺癌 罗格列酮 基因治疗

　　近年胰腺癌发病率在国内外呈上升趋势， 起病隐蔽， 发展迅速， 又缺乏有效的早期诊断和系统治疗方法， 胰腺癌早期诊断以及治疗水平均较低， 促使人们不断寻求其新型有效的治疗分子靶点[1]。目前， 胰腺癌基因治疗还处于探索阶段， 抑癌基因将在胰腺癌基因治疗中发挥重要作用。研究发现人类胰腺癌表达PPARγ， PPARγ配体可以抑制巨噬细胞的活化以及浸润， 是肿瘤新生血管形成重要的调节因子[2]， 激活PPARγ能够产生抗胰腺癌生长的效应。PTEN基因， 是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因， 参与细胞周期调控， 同时调节细胞正常生长和发育[3]。有研究表明50%的胰腺癌有染色体10q的缺失[1]， 而10q正是PTEN基因位点所在。近年来随着对肿瘤发病机制的不断深入研究， 发现PPARγ、 PTEN与胰腺癌发生、 发展有着密切的联系。本研究中通过体外培养人胰腺癌细胞株， 给予PPARγ激动剂罗格列酮， 利用RTPCR、 免疫细胞化学、 流式细胞术（FCM）检测等方法， 观察胰腺癌细胞株中抑癌基因PTEN表达的影响， 为进一步探讨PPARγ抑制胰腺癌的机制提供一定的理论支持， 为胰腺癌基因治疗提供新思路。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 人胰腺癌细胞株PANC1（human pancreatic cancer cells， PANC1）， 购自意大利ISTBanca公司。RNA提取试剂（TRIzol Reagent）、 Taq DNA聚合酶、 反转录酶Super scriptⅢ、 DL 2000 marke、 DMEM培养基均为Gibco公司产品。胎牛血清为杭州四季青公司产品。引物由大连宝生公司合成。格列酮为葛兰素史克公司产品。GW9662为Sigma公司产品。PTEN antibody、 二抗、 辣根过氧化物酶（HRP）标记为武汉博士德公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计 通过人PTEN信号肽和编码区基因序列设计引物， 在GenBank中获得所需PTEN的基因序列， 由大连宝生生物技术有限责任公司合成。人PTEN的基因序列: sense primer 5′CCA GAC ATG ACA GCC ATC3′; antisense primer 5′GAA CTT GTC TTC CCG TCG3′。人βactin的基因序列: Sense primer 5′GAG GAT CTT CAT GAG GTA GTC TGT CAG GTC3′; antisense primer 5′CAA CTG GGA CGA CAT GGA GAA GAT CTG GCA3′。

　　1.2.2 细胞培养 PANC1细胞从液氮中取出后， 迅速置于37℃水浴解冻复苏， 加入37℃预热无血清DMEM培养液， 800 r/min离心5 min， 弃上清; 细胞沉淀加入DMEM完全培养液（内含150 mL/L胎牛血清、 35.76 g/L HEPES、 青、 链霉素各100 U/mL）重悬， 置于75 cm2塑料瓶， 在含50 mL/L CO2的37℃孵箱里贴壁生长至融合， 隔日换液， 当细胞生长至80%～90%融合时， 用1.25 g/L胰蛋白酶消化传代。选择生长良好的PANC1细胞， 接种于6孔细胞培养板， 接种密度为1×104/孔。

　　1.2.3 细胞总RNA的提取 使用罗格列酮和GW9662细胞分别处理PANC1细胞， 使用PBS溶液(含1 μmol/L DMSO， pH7.4)处理空白对照组细胞。罗格列酮组， 细胞培养体系中分别加入1 μmol/L、 10 μmol/L罗格列酮溶液(1 μmol/L DMSO)， 50 mL/L CO2、 37℃孵育2、 6、 12、 24、 48 h; GW9662组， 细胞培养体系中加入10 μmol/L GW9662溶液(1 μmol/L DMSO)， 50 mL/L CO2、 37℃孵育48 h。

　　1.2.4 RTPCR 反应体系50 μL按以下反应条件进行RTPCR反应: 混匀， 离心10 s; 94℃预变性5 min; 变性94℃ 50 s; 退火60℃ 45 s; 延伸72℃ 90 s; 共25个循环; 末次循环后， 72℃再延伸10 min; 样品冷却后4℃保存。

　　1.2.5 琼脂糖凝胶电泳 取PCR产物5 μL， 加1 μL的loading buffer混匀， 加入样品孔内; 接通电源， DNA样品由负极向正极泳动， 电压为5 V/cm， 30 min后终止电泳; 5 mg/L溴化乙锭（EB）染色， 凝胶成像仪观察图像。

　　1.2.6 细胞爬片的制备 选择对数生长期PANC1细胞， 用1.25 g/L胰蛋白酶液消化制成单细胞悬液， 调节细胞密度，　　将细胞接种于预先准备好玻片的培养皿中（0.1 g/L多聚赖氨酸处理载玻片）; 细胞分为罗格列酮和GW9662处理组， 空白对照组的细胞用PBS溶液(含1 μmol/L DMSO， pH7.4)处理。罗格列酮组， 细胞培养体系分别加入1 μmol/L和10 μmol/L罗格列酮溶液(1 μmol/L DMSO)， 50 mL/L CO2， 37℃孵育48 h; GW9662组， 细胞培养体系加入10 μmol/L的GW9662溶液(1 μmol/L DMSO)， 50 mL/L CO2， 37℃孵育48 h。待细胞再次进入对数生长期， 取出玻片， PBS洗涤， 4℃丙酮固定10 min， PBS洗2遍， 37℃烘干， -20℃冻存备用。

　　1.2.7 免疫组织化学染色 免疫组织化学染色采用SABC法， 具体步骤参考说明书进行。阴性对照用PBS代替一抗。荧光显微镜观察结果， 细胞中出现棕黄色颗粒判为阳性。

　　1.2.8 FCM检测PTEN蛋白的表达 选择生长良好的PANC1细胞， 分为罗格列酮和GW9662处理组， 空白对照组的细胞用PBS溶液(含1 μmol/L DMSO， pH7.4)处理。罗格列酮组， 细胞培养体系加10 μmol/L的罗格列酮溶液(1 μmol/L DMSO)， 50 mL/L CO2， 37℃孵育48 h; GW9662组细胞， 加入10 μmol/L的GW9662溶液(1 μmol/L DMSO)， 50 mL/L CO2， 37℃孵育48 h。1.25 g/L胰酶消化PANC1细胞， 制备悬液， 调整细胞密度为1×109/L; 1 mL的 PANC1细胞悬液中， 分别加入PTEN抗体和IgG对照抗体（1 μL， 1∶200）， 标记荧光， 37℃水浴1 h， PBS缓冲液离心冲洗; 再加入20 g/L多聚甲醛40 μL固定。FCM测定PANC1细胞中PTEN蛋白表达的百分率。

　　1.2.9 统计学处理 全部数据均以x±s表示， 应用SPSS10.0统计软件进行t检验， 分析各组结果差异。

　　2 结果

　　2.1 PPARγ调节胰腺癌PANC1细胞中PTEN基因表达 罗格列酮与人胰腺癌PANC1细胞孵育2～48 h后， 结果表明人胰腺癌PANC1细胞中PTEN基因的表达明显增高， 并呈一定的剂量依赖性; 而PPARγ的抑制剂GW9662与人胰腺癌PANC1细胞孵育后， 能够明显抑制PTEN基因的表达。凝胶上出现约为1063 bp的条带为所需片段， 即为PTEN基因片段（图1、 2）。

　　图1 罗格列酮对PTEN基因表达的影响（略）

　　Fig 1 Expression of PTEN in pancreatic cancer cells PANC1 is effected by rosiglitazone

　　A: Rosiglitazone 1 μmol/L; B: Rosiglitazone 10 μmol/L. M: DNA marker; 1: Normal; 2: 2 h; 3: 6 h; 4: 12 h; 5: 24 h; 6: 48 h.

　　图2 抑制剂GW9662对PTEN基因表达的影响（略）

　　Fig 2 Expression of PTEN in pancreatic cancer cells PANC1 is effected by Inhibitor GW9662

　　M: DNA marker; 1: Normal; 2: Rosiglitazone 1 μmol/L; 3: Rosiglitazone 10 μmol/L; 4: GW966210 μmol/L.

　　2.2 PPARγ调节胰腺癌PANC1细胞中PTEN蛋白表达 与正常对照组相比， 经过10 μmol/L罗格列酮处理48 h的细胞， 细胞质中棕黄色颗粒明显增加， 细胞核被苏木素染成蓝紫色; 而经过10 μmol/L GW9662 处理的细胞， 细胞质中无明显的棕黄色颗粒， 细胞核被苏木素染成蓝紫色; 提示过氧化物酶增殖物活化受体γ(PPARγ )的激动剂罗格列酮能够诱导PTEN蛋白的表达， 而抑制剂GW9662能够抑制PTEN蛋白的表达（图3）。

　　图3 PPARγ调节胰腺癌PANC1细胞中PTEN蛋白表达（略）

　　Fig 3 Expression of PTEN in pancreatic cancer cells PANC1 regulated by PPARγ(×400)

　　A: Normal group; B: Rosiglitazone group; C: GW9662 group.

　　2.3 FCM 观察PPARγ对PTEN表达的影响 正常对照组人胰腺癌PANC1细胞中， PTEN蛋白表达的百分率为（2.17±0.17）， 而加入PPARγ的激动剂罗格列酮处理后， PTEN蛋白表达的百分率明显增高， 为（5.81±0.30， P&<0.01）; 加入PPARγ的抑制剂GW9662处理后， PTEN蛋白表达的百分率降低， 为（1.15±0.20， P&<0.05， 图4）。

　　图4 FCM观察PPARγ对PTEN表达的影响（略）

　　Fig 4 FCM observe the expression of PTEN by PPARγ

　　a: Normal group; b: Rosiglitazone group; c: GW9662 group.

　　3 讨论
　　
　　胰腺癌发病率相对低于其他消化系统恶性肿瘤， 但其恶性程度高， 发展快， 是一种预后较差的恶性肿瘤。近年来， 随着对肿瘤发病机制的研究不断深入， 发现PPARγ、 PTEN与胰腺癌的发生、 发展有着密切的联系。人类胰腺癌主要存在PPARγ的表达[4]， 人胰腺癌中PPARγ的表达及其作用迄今未完全阐明。有研究证实激活PPARγ活化后通过多种途径使人类胰腺癌细胞生长停滞于G1期， 抑制胰腺癌细胞的生长， 对人胰腺癌的生长具有负向调节作用。Itami等[5]发现在PPARγ胰腺癌细胞系KMP3的过表达导致了脂质体积聚， 显示了癌细胞生长可能部分上是通过脂肪形成过程中的终末分化所导致， PPARγ活化后使p27 Kip1增加而导致细胞生长停滞于G1期。Motomura等[6]对胰腺癌细胞系PK1及PK9的研究显示， PPARγ活化后对胰腺癌细胞动力的抑制作用和细胞形态学的改变是通过调节细胞肌动蛋白的结构而实现的。Kawa等[7]对胰腺癌的研究显示， 人类胰腺癌中p21的表达降低， 促进了胰腺癌的发生、 发展， PPARγ活化可增高p21 mRNA和蛋白的表达， 通过对cyclinCDK2和cyclinCDK4活性的抑制作用降低Rb蛋白的磷酸化， 从而使细胞生长停滞于G1期。Farrow等[8]在胰腺癌细胞系AsPC1中通过PPARγ活化， 而使肿瘤细胞侵袭因子组织纤维蛋白溶酶原激活因子的分泌水平降低， 发挥其抑制AsPC1细胞侵袭力的作用。Monden等[9]用15dPGJ 2作用于胰腺癌细胞发现， PPARγ活化后抑制MMP2 和MMP9的表达而抑制癌细胞的侵袭能力。
　　
　　PTEN是于1997年新发现的与肿瘤关系密切的抑癌基因， 在细胞凋亡和迁移中发挥作用， 是控制细胞周期启动或退出、 促进分化、 启动修复或调节细胞死亡程序中信号转导途径的主要成分。PTEN可以拮抗PI3K对PKB的激活作用， 从而阻断该信息传导通路， 调控细胞增殖和细胞周期， 抑制细胞的生长， 在肿瘤细胞转移中发挥作用[10]。它参与细胞周期以及多种信号途径的负调控， 抑制细胞的多种生理活动从而阻断细胞生长， 若PTEN失活会导致细胞失控性生长形成恶性肿瘤; 有研究表明50%的胰腺癌有染色体10q的缺失， 而10q正是PTEN基因位点所在[1]。胰腺癌有较高的p53突变率， PTEN的基因表达部分受p53调控。该基因的突变失活与人类多种肿瘤的发生发展密切相关， 国外有研究初步证实胰腺癌有PTEN基因突变， 它与胰腺癌的发生、 发展有关[11]。PPARγ配体的作用，都是通过激活或抑制PPARγ的靶基因而发挥作用的。已知adipophilin、 LFABP、 RegIA、 Gob4和NGAL这5个基因是由PPARγ直接调控的靶基因[12]。已有研究者假设， PTEN基因也可能与PPARγ配体活化相关。
　　
　　本研究中， 胰腺癌细胞株， 给予PPARγ激动剂罗格列酮， 利用RTPCR、 免疫细胞化学、 FCM等手段， 分别从基因水平以及蛋白水平观察罗格列酮对胰腺癌细胞株抑癌基因PTEN表达的影响， 同时应用抑制剂GW9662进一步对比， 结果表明罗格列酮能够明显诱导抑癌基因PTEN的表达， 提示罗格列酮与PPARγ结合， 激动PPARγ， 可能通过一定信号转导通路， 诱导抑癌基因PTEN高表达， 从而可能影响胰腺癌细胞生长、 分化、 转移、 黏连、 增殖及细胞周期， 促进凋亡， 抑制肿瘤细胞的转移和侵袭。进而为进一步探讨PPARγ抑制胰腺癌的机制提供一定的理论支持。

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