多房棘球绦虫重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗诱导小鼠细胞因子变化的研究

【摘要】 目的: 研究多房棘球绦虫重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗对原头蚴攻击小鼠细胞因子变化的影响。方法: 将重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗分别通过皮下注射、 肌肉注射、 鼻腔黏膜接种和口服接种免疫BALB/c小鼠12周后， 用50个多房棘球绦虫原头蚴腹腔注射进行攻击， 攻击感染后18周剖杀小鼠， 取脾脏制备淋巴细胞悬液体外培养， 分别以多房棘球绦虫抗原(EmAg)、 刀豆素A(ConA)刺激诱生白细胞介素12(IL12)、 白细胞介素10(IL10)和干扰素γ(IFNγ); 以脂多糖(LPS)刺激诱生肿瘤坏死因子α(TNFα)。常规ELISA测定脾细胞培养上清液中IL12、 IL10、 IFNγ和TNFα水平。结果: 与对照组相比，疫苗免疫组IFNγ、 IL12、 TNFα水平增加， IL10水平降低， EmAg刺激组和ConA或LPS刺激组细胞因子水平明显高于相应的原液组。结论: 多房棘球绦虫重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗可诱导攻击感染小鼠产生Th1型细胞免疫应答， 增强宿主抗多房棘球绦虫感染的保护性免疫反应。

【关键词】 多房棘球绦虫 重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗 原头蚴 细胞因子

　　泡型包虫病(alveolar echinococcosis， AE)是由多房棘球绦虫(echinococcus multilocularis， Em)的续绦期幼虫寄生在人体引起的一种严重危害人体健康的人畜共患寄生虫病(zoonosis)。泡球蚴在宿主肝脏呈现酷似肿瘤的侵润性生长， 可诱发宿主的体液免疫和细胞免疫［1］。初始T细胞获得泡球蚴抗原识别信号而活化为效应T细胞， 通过细胞因子而进行免疫调节。近年来研究发现， Thl和Th3细胞产生的细胞因子在病程转归中具有重要作用， 可反映宿主机体内免疫应答的反应类型。李富荣等［2］报道小鼠感染泡球蚴后的前12周脾淋巴细胞以分泌IL2R和TNFα为主， 前8周呈Th1反应; 12周后以IFNγ为主; 16周后以IL1为主， 感染后期Th3反应逐渐增强; 舒勍［3］发现A/J小鼠对泡球蚴有相对较强的抵抗力与T细胞增生导致高水平的Th1细胞因子IL2和IFNγ有关; 魏晓丽等［4］报道IFNγ、 TNFα等Th1型细胞因子接种泡球蚴后水平均上升， 而IL4、 IL10 等Th3型细胞因子相对维持较低水平， 这些资料表明细胞因子在宿主对泡球蚴的免疫应答中可能起重要作用。本研究在成功构建重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗［5］的基础上， 用该疫苗免疫小鼠， 然后用多房棘球绦虫原头蚴攻击感染， 研究Thl和Th3型细胞因子的变化， 探讨该疫苗的保护性免疫机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗［5］由本室构建和保存; Bb购自武汉大学菌种保存中心。纯系BALB/c小鼠(雌性， 体质量20～25 g， 12～14周龄， 共78只)购自重庆医科大学实验动物中心。ConA购自Sigma公司; RPMI1640培养基、 100 g/L BSA、 青霉素和链霉素购自上海生工公司; IL12、 IL10、 IFNγ和TNFα检测试剂盒购自北京晶美公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验分组 78只雌性BALB/c小鼠随机分为6组， 每组13只。SC组: rBbEmⅡ/3Em1433皮下注射组; IM组: rBbEmⅡ/3Em1433肌肉注射组; IN组: rBbEmⅡ/3Em1433鼻腔黏膜接种组; PO组: rBbEmⅡ/3Em1433口服接种组; Bb对照组: 100 μL Bb菌液皮下注射组; PBS对照组: 100 μL PBS皮下注射组。SC、 IM组: 5×106 CFU疫苗悬浮于100 μL PBS于小鼠后背部皮下单次及肌肉注射; IN组: 5×105 CFU疫苗悬浮于10 μL PBS于小鼠鼻腔黏膜单次接种; PO组: 1×108 CFU疫苗悬浮于60 μL PBS进行口服接种。至室验结束时， SC、 IN组有3只小鼠死亡， PO组有4只小鼠死亡， IM、 Bb、 PBS组各有1只小鼠死亡。

　　1.2.2 攻击感染 疫苗免疫小鼠12周后， 用50个多房棘球绦虫原头蚴腹腔注射进行攻击感染。

　　1.2.3 脾细胞制备 原头蚴攻击感染后18周随机挑选各组小鼠8只剖杀， 750 mL/L乙醇消毒3 min， 无菌取脾， 剪碎， 用注射器针芯碾磨， 1 mL8.5 mL/L生理盐水冲洗， 200目尼龙网过滤， 滤液置10 mL离心管; 加4 mL双蒸水使渗透压降至0.15%溶解红细胞， 10 s， 再加1.34 mL36 mL/L生理盐水恢复等渗; 用8.5 mL/L生理盐水洗2次， 2500 r/min离心5 min， 加入10 mL8.5 mL/L生理盐水混匀， 计数细胞， 调整细胞密度为5×109/L， 加入含100 g/L BSA的RPMI1640培养液10 mL， 加入青霉素100 U/mL和链霉素100 U/mL。

　　1.2.4 脾细胞培养上清液的制备 将5×109/L脾细胞加入24孔细胞培养板， 每份标本设6孔， 分别加入1 mL原液、 1 mL 原液＋EmAg 10 mg/L、 1 mL原液＋ConA 10 mg/L、 1 mL原液、 1 mL原液＋EmAg 10 mg/L和1 mL原液＋LPS 10 mg/L， 前3孔37℃50 mL/LCO2培养48 h， 4000 r/min离心5 min， 收集上清液， -20℃冰箱冻存待查IL12、 IL10和IFNγ; 后3孔37℃50 mL/LCO2培养72 h， 4000 r/min离心5 min， 收集上清液， -20℃冰箱冻存待查TNFα。

　　1.2.5 脾细胞产生的IL12、 IL10、 IFNγ和TNFα检测 按ELISA试剂盒说明书的实验步骤， 对小鼠血清中IL12、 IL10、 IFNγ和TNFα的含量分别进行检测， 酶标仪测定A450值， 以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线， 计算细胞因子含量。

　　1.2.6 统计学分析 各组小鼠脾细胞产生的4种细胞因子浓度采用SPSS13.0软件进行分析， 计量资料采用t检验（x±s）， 检测结果采用方差分析， 组间两两比较用LSD。

　　2 结果

　　2.1 IFNγ检测结果 SC～PO组中， 小鼠脾细胞原液组、 EmAg刺激组和ConA刺激组IFNγ水平均明显高于PBS对照组(P&<0.01); Bb对照组与PBS对照组相比， 差别无统计学意义; 每个ConA刺激组IFNγ水平明显高于相应的原液组或EmAg刺激组(P&<0.05或P&<0.01)。在EmAg刺激组和ConA刺激组中， SC组IFNγ水平明显高于IM组、 IN组和PO组(P&<0.05或P&<0.01)， IM组、 IN组和PO组之间无统计学意义(表1)。

　　表1 重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗免疫原头节攻击后小鼠IFNγ的检测（略）

　　Tab 1 Detection of IFNγ in mice immunized with recombinant Bb vaccine and challenged with protoscoleces

　　bP&<0.01 vs PBS control group.

　　2.2 IL12检测结果 SC组和IN组小鼠脾细胞原液组、 EmAg刺激组和ConA刺激组IL12水平均明显高于PBS对照组(P&<0.05或P&<0.01); IM组、 PO组和Bb对照组与PBS对照组相比， 差别无统计学意义。EmAg刺激组和ConA刺激组中， SC组IL12水平明显高于IM组和PO组(P&<0.05或P&<0.01)， 余无统计学意义。每个ConA刺激组IL12水平明显高于相应的原液组或EmAg刺激组(P&<0.05或P&<0.01); 每个EmAg刺激组IL12水平明显高于相应的原液组(P&<0.05或P&<0.01， 表2)。

　　表2 重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗免疫原头节攻击后小鼠IL12的检测（略）

　　Tab 2 Detection of IL12 in mice immunized with recombinant Bb vaccine and challenged with protoscoleces

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs PBS control group.

　　2.3 TNFα检测结果 SC组、 IM组和IN组小鼠脾细胞原液组、 EmAg刺激组和LPS刺激组TNFα水平均明显高于PBS对照组(P&<0.05或P&<0.01); PO组和Bb对照组与PBS对照组相比， 差别无统计学意义。在EmAg刺激组和LPS刺激组中， SC组TNFα水平明显高于IM组、 IN组和PO组(P&<0.01)。每个LPS刺激组TNFα水平明显高于相应的原液组或EmAg刺激组(P&<0.01); 每个EmAg刺激组TNFα水平明显高于相应的原液组(P&<0.01， 表3)。

　　表3 重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗免疫原头节攻击后小鼠TNFα的检测（略）

　　Tab 3 Detection of TNFα in mice immunized with recombinant Bb vaccine and challenged with protoscoleces

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs PBS control group.

　　2.4 IL10检测结果 SC组和IM组小鼠脾细胞原液组、 EmAg刺激组和ConA刺激组IL10水平与PBS对照组相比明显降低， 差别有统计学意义(P&<0.05或P&<0.01); IN组、 PO组和Bb对照组与PBS对照组相比， 差别无统计学意义。每个ConA刺激组IL10水平明显高于相应的原液组或EmAg刺激组(P&<0.05或P&<0.01); 每个EmAg刺激组IL10水平明显高于相应的原液组(P&<0.05或P&<0.01， 表4)。

　　表4 重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗免疫原头节攻击后小鼠IL10的检测（略）

　　Tab 4 Detection of IL10 in mice immunized with recombinant Bb vaccine and challenged with protoscoleces

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs PBS control group.

　　3 讨论
　　
　　IFNγ是由抗原诱生的Th1型细胞因子， 在抗寄生虫感染的防御机制中能抑制Th3型细胞因子的分泌， 主要通过增强巨噬细胞吞噬功能和限制细胞内寄生原虫的增殖发育等方式控制感染。王昌源等［6］用多房棘球绦虫ELP重组蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠可使小鼠淋巴细胞产生IFNγ， 诱生Th1型免疫应答， 提示IFNγ检测是研究免疫应答较敏感的指标。有资料表明对治疗成功的棘球蚴病患者， 具有低水平的IL10、 IL4， 伴有高水平的IFNγ; 反之对治疗通常无反应［7］。本研究中， 4种不同的疫苗免疫方式产生的IFNγ水平均明显高于PBS对照组， 皮下注射组明显高于肌肉注射组、 鼻腔黏膜接种组以及口服接种组， 提示rBbEmⅡ/3Em1433疫苗免疫可诱生IFNγ为主的Th1型细胞免疫应答， 增强宿主抗泡球蚴感染。
　　
　　IL12主要由单核/巨噬细胞、 NK细胞和B细胞分泌， 是一种多活性的细胞因子。IL12基因敲除鼠不仅脾细胞分泌IFNγ的能力下降， 而且其巨噬细胞的吞噬调理作用也明显低下［8］。本研究发现， 皮下注射组和鼻腔黏膜接种组的IL12水平明显高于PBS对照组， 可见rBbEmⅡ/3Em1433疫苗免疫后可增加小鼠IL12水平， 高水平的IL12能够启动感染早期以分泌高水平IFNγ为主的Th1细胞免疫应答反应， IFNγ还具有进一步促进巨噬细胞分泌IL12 的能力， 这样在IFNγ和IL12之间形成一种正反馈放大效应。
　　
　　TNFα是由活化的巨噬细胞和T细胞分泌的细胞因子， 能激活T细胞， 刺激B细胞产生抗体， 刺激单核巨噬细胞产生IL1和TNFα， 并促进分泌IL2和IFNγ［9， 10］。本研究中， 皮下注射组、 肌肉注射组和鼻腔黏膜接种组TNFα水平明显高于PBS对照组， 可以提示rBbEmⅡ/3Em1433疫苗免疫小鼠原头节攻击后TNFα水平可显著增加， TNFα通过活化巨噬细胞产生大量的活性氧自由基O-2、 h3O2和NO等杀伤寄生虫，达到保护宿主的目的。此外， TNFα与IFNγ还存在协同作用［11］， 这与本实验测定的TNFα和IFNγ的变化规律相符。
　　
　　IL10是由Th3细胞产生的一种细胞因子合成抑制因子， 可抑制Th1细胞克隆合成细胞因子， 促进B细胞增殖分化和产生抗体， 具有双向调节作用。Sturm等［12］发现多数泡型棘球蚴病患者有IL5 增高， 在IgG和IgG4高水平的患者血清中IL4、 IL5、 IL10水平也相应增高。IL10的作用使寄生虫得以逃避宿主的免疫攻击， 同时避免宿主的免疫损伤。李富荣等［13］研究发现AE患者疾病的严重程度与Th3细胞因子的表达水平有关。本研究发现， 皮下注射组和肌肉注射组IL10水平明显低于PBS对照组， 提示rBbEmⅡ/3Em1433疫苗免疫后可抑制IL10的分泌， 降低Th3型细胞因子引起的病理损伤， 抑制泡球蚴在宿主体内的生长。
　　
　　综上所述， 本研究用重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗免疫小鼠， 原头节攻击后， 可诱导IFNγ、 IL12、 TNFα等Th1型细胞因子的分泌增加， 激活巨噬细胞和NK细胞， 促进Th和Tc细胞的增殖分化和成熟， 增强它们杀伤泡球蚴的作用;同时可抑制IL10等Th3型细胞因子的分泌， 限制宿主细胞内泡球蚴的增殖发育， 从而增强保护性免疫效应。4种不同的免疫途径相比， 皮下注射组的免疫效果更佳， 可能与接种剂量以及不同接种途径将抗原提呈给免疫系统的效力不同有关。每个ConA或LPS刺激组和EmAg刺激组细胞因子水平明显高于相应的原液组， 提示脾细胞在体外被抗原刺激下， 可分泌更高水平的细胞因子， 发挥各自的生物学效应， 加强宿主抗多房棘球绦虫感染的保护性免疫反应。

参考文献

　　［1］ Bander B， Auer H， Schileher F， et al. Experimental investigations on the B and T cell immune response in primary alveolar Echinococcosis［J］. Parasite Immunol， 1999， 21(8): 409-421.

　　［2］ 李富荣， 石佑恩， 史大中， 等. 泡球蚴感染BALB/c小鼠IgG亚类和细胞因子的动态观察［J］. 中国奇生虫学与寄生虫病杂志， 2003， 21(6): 357-360.

　　［3］ 舒 勍. 继发性多房棘球绦虫感染的A/J小鼠: 泡球蚴迟滞发育与Th1细胞因子的关系［J］. 国外医学·寄生虫病分册， 1998， 25(6): 280-281.

　　［4］ 魏晓丽， 丁剑冰， 许 晏， 等. 小鼠感染泡球蚴后细胞因子水平的变化［J］. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志， 2004， 22(6): 361-364.

　　［5］ 杨 梅， 李文桂， 朱佑明. 多房棘球绦虫重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗的构建及鉴定［J］. 中国人兽共患病学报， 2007， 23(10): 1026-1029.

　　［6］ 王昌源， 陈雅棠， 余登高， 等. 多房棘球绦虫ELP重组蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠引起的免疫应答［J］. 免疫学杂志， 2003， 19(4): 285-288， 292.

　　［7］ Rigano R， Bofumo E， Teggi A， et al. Production of IL5 and IL6 by peripheral blood mononuclear cells(PBMC) from patients with Echinococcus granulosus infection ［J］. Clin Exp Immunol， 1996， 105(3): 456-459.

　　［8］ Bastos KR， Barboza R， Elias RM， et al. Impaired macrophage responses may contribute to exacerbation of bloodstage Plasmodium chabaudi malaria in interleukin12deficient mice［J］. J Interferon Cytokine Res， 2002， 22(12): 1191-1199.

　　［9］ 吴 婷， 陈 敏， 欧山海， 等. 不同HBsAg疫苗联合免疫后诱导小鼠细胞和体液免疫应答的研究［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22(5): 568-570.

　　［10］ 张 海， 师长宏， 薛 莹， 等. 结核分支杆菌ESAT6CFP10融合蛋白诱导的小鼠免疫应答及其保护力［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22(4): 443-446.

　　［11］ 蒋次鹏. 寄生虫感染与细胞因子［J］. 中国寄生虫病防治杂志， 2001， 14(2): 150-153.

　　［12］ Sturm D， Menzel J， Gosttein B， et al. IL5 is the predominant cytokine produced by PBMC in alveolar echinococcosis［J］. Infect Immun， 1995， 63(5): 1688-1697.

　　［13］ 李富荣， 石佑恩， 史大中， 等. 泡球蚴病患者血清中Th1/Th3型细胞因子水平的观察［J］. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志， 2002， 20(6): 376-377.