检测可溶性B7H4 ELISA夹心法的建立

【摘要】 目的: 建立定量检测可溶性B7H4的ELISA夹心法。方法: 采用抗人B7H4单克隆抗体(mAb)包被酶标板， 以兔抗鼠B7H4多克隆抗体为夹心抗体、 HRP标记羊抗兔IgG为检测抗体、 重组小鼠可溶性B7H4为标准品， 建立检测可溶性B7H4的间接ELISA法， 并对50例正常人和37例术后乳腺癌患者血清样本进行了检测。结果: 建立的夹心ELISA法检测B7H4的线性范围为3.13 μg/L～200 μg/L， 批内、 批间变异系数分别为7.92%和11.1%。50例正常人和37例术后乳腺癌患者血清B7H4的含量分别为（31.62±9.85） μg/L和（42.52±16.63） μg/L， 两者比较差异有统计学意义（P&<0.001）。结论: 成功建立了一种灵敏度高、 稳定性好的检测可溶性B7H4的夹心ELISA法。

【关键词】 ELISA 夹心法 B7H4 乳腺癌

　　B7H4（又称B7S1和B7x）是最新发现的B7家族成员， 能通过抑制T细胞的增殖、 细胞因子的产生和细胞周期的进程来负相调控T细胞的免疫应答。人B7H4位于染色体1p11.1， 基因组DNA包括6个外显子和5个内含子， 编码区849个碱基。鼠的B7H4基因位于3号染色体， 也包括6个外显子和5个内含子［1］。人和鼠的B7H4氨基酸有87%的同源性［2］。有实验证明在卵巢癌、 肺癌、 乳腺癌等患者血清中可溶性B7H4增高［3-7］， B7H4被认为是一种新的肿瘤标志物。我们克隆了小鼠B7H4基因， 构建了相应的真核和原核表达载体［8］， 为了进一步研究B7H4在肿瘤发生发展中的作用， 本研究建立了一种检测可溶性B7H4的ELISA方法。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 酶联微量反应板， 来源于coning公司。抗人B7H4单克隆抗体(mAb)， 购自eBioscience公司， 蛋白质Marker购于天根生化科技有限公司， 镍离子金属螯合柱(NiNTA)购自Invitrogen（美国）公司， HRP标记羊抗兔IgG， 购自北京博奥森生物技术有限公司， pETmB7H4表达载体由本室构建， TMB底物及显色剂， 沈阳惠民公司产品。BIOTEK Elx800型酶标仪等。

　　1.2 方法

　　1.2.1 mB7H4免疫原的制备 将表达重组小鼠B7H4的原核表达载体pETmB7H4转化表达菌E.coli BL21 (DE3)， 于30℃、 1 mol/L IPTG条件下诱导表达4 h的表达， 收集菌体， 超声破碎菌体， 提取包涵体， 并用8.0 mol/L尿素溶解， 用镍离子金属螯合柱(NiNTA)（Invitrogen）纯化目的蛋白(按公司提供的操作说明进行)， 收集洗脱液。经SDSPAGE鉴定纯化的重组B7H4蛋白。将重组鼠B7H4原核表达蛋白（1 g/L）与等体积的弗氏完全佐剂混合研磨、 乳化， 制备成免疫抗原。

　　1.2.2 兔抗小鼠B7H4多克隆抗体的制备 取3只健康雄性新西兰白兔， 依次于双后腿足跖、 双后腿腘窝淋巴结、 背部皮内和背部皮下， 分4次免疫， 每周免疫1次， 每次免疫1 mg 重组小鼠B7H4蛋白， 末次免疫后1周采血， 分离血清， 56℃ 30 min灭活， 以半饱和硫酸铵盐析初步纯化IgG。采用ELISA法检测抗体的效价， 双向琼脂扩散法检测抗体的特异性。将抗体分装于-20℃冻存备用。

　　1.2.3 双抗体夹心间接ELISA方法的建立 用0.05 mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗人B7H4 mAb， 包被可拆酶标板， 置4℃过夜， 用PBST洗涤3次。采用100 mL/L FCS封闭， 200 μL/ 孔， 37℃作用2 h后用PBST洗涤3次。用PBSTBSA将重组小鼠B7H4做适当稀释。在包被好的酶标板中加入待测血清标本100 μL/孔， 用重组小鼠B7H4蛋白作为标准品。37℃作用1 h， 用PBST洗3次。加入工作浓度兔抗小鼠B7H4多克隆抗体， 100 μL/孔， 37℃作用1 h后用PBST洗3次， 再加入工作浓度HRP标记羊抗兔IgG， 37℃作用1 h后用PBST洗3次， 按100 μL/孔加显色底物， 作用15 min， 以2 mol/L硫酸终止， 在酶标仪上测A450值。

　　1.2.4 ELISA方法的条件优化 将兔抗小鼠B7H4多抗稀释为100 μg/L， 酶标抗体进行一系列稀释（1∶2 000～1∶8 000）， 加底物显色， 选取A450值为1.0时的酶标抗体浓度为工作浓度。然后将抗人B7H4 mAb稀释为1∶2 000、 1∶4 000、 1∶6 000， 用100 μg/L重组小鼠B7H4为强抗原， 5 μg/L重组小鼠B7H4为弱抗原， 稀释液为阴性对照， 多抗稀释为1∶500、 1∶1 000、 1∶1 500， 采用棋盘滴定法确定包被抗B7H4 mAb浓度和多抗最适工作浓度。分别用100 mL/L FCS、 200 mL/L FCS和10 mL/L BSA做封闭液， 4℃过夜和37℃ 2 h封闭， 选取最佳封闭条件。

　　1.2.5 测定范围的确定 将重组鼠B7H4蛋白（200 mg/L）做1∶1 000稀释后再进一步做二倍稀释， 如1∶2 000、 1∶4 000、 1∶8 000， 直到1∶256 000进行测定， 以抗原浓度为横座标， A450为纵座标， 绘制标准曲线， 确定检测范围及最小检出浓度。

　　1.2.6 重复性测定 (1)批内试验: 在同一批内对50 μg/L纯化重组小鼠B7H4进行20次平行检测， 测其A450， 计算CV值。(2)批间试验: 分5次检测50 μg/L纯化抗原， 每次设4个重复孔， 测其A450， 计算CV值。

　　1.2.7 标本检测 采用上述建立的方法对50份健康体检者血清样本和37份术后乳腺癌患者血清样本进行检测， 每个样本设立两个平行检测， 取平均A值计算样本中B7H4的含量。

　　2 结果

　　2.1 重组B7H4和兔抗小鼠B7H4多克隆抗体的鉴定

　　2.1.1 重组B7H4的鉴定 图1为SDSPAGE分析纯化重组mB7H4纯度的结果， 图中显示纯化的蛋白达到电泳纯， 可作为免疫原免疫动物， 并可作为参考标准品检测可溶性B7H4。

　　图1 纯化重组mB7H4的鉴定（略）

　　1: 纯化的mB7H4; 2: 结合mB7H4的NiNTA清洗液; 3: 经1 mmol/L IPTG诱导的含pETmB7H4的BL21(DE3)菌; M: Protein marker.

　　2.1.2 兔抗小鼠B7H4多克隆抗体的鉴定 采用双向琼脂扩散试验检测制备的兔抗mB7H4的效价， 结果为1∶16; 用纯化的mB7H4包被酶标板（1.0 mg/L）， 采用间接ELISA法鉴定抗血清效价， 结果测得效价为1∶12 800; 将兔抗mB7H4多抗与抗人B7H4 mAb采用免疫组化法同时检测肺癌患者肿瘤组织中B7H4的表达， 结果两者均为阳性（图2）。

　　图2 免疫组化法检测肺腺癌患者肿瘤组织中B7H4的表达（略）

　　A: 兔抗mB7H4多抗; B: 抗人B7H4单抗; C: 同型对照.

　　2.2 双抗体夹心ELISA检测方法最佳反应条件的确定

　　2.2.1 酶标抗体最佳工作浓度的确定 包被100 μg/L多抗， 酶标抗体稀释为1∶2 000、 1∶3 000、 1∶4 000、 1∶5 000、 1∶6 000、 1∶7 000、 1∶8 000， 显色后分别检测其A450值， 确定酶标抗体的最佳工作浓度为1∶5 000。

　　2.2.2 包被mAb和检测多抗最适工作浓度的确定 根据棋盘法测定的结果， 取强阳性抗原A450值为1.0左右， 阴性对照A450值小于0.1的测定孔， 确定mAb最适工作浓度为1∶2 000， 多抗最适工作浓度为1∶1 000。

　　2.2.3 封闭液的选择 分别采用100 mL/L FCS、 200 mL/L FCS和10 mL/L BSA做封闭液， 结果100 mL/L FCS与200 mL/L FCS无明显区别， 而10 mL/L BSA封闭的阴性对照孔A450值明显大于100 mL/L FCS封闭的阴性对照A450值， 所以采用100 mL/L FCS做为封闭液。4℃过夜和37℃ 2 h封闭方法相比无明显区别， 为节约时间采用37℃ 2 h封闭。

　　2.2.4 测定范围的确定 原浓度为200 mg/L的抗原倍比稀释为1∶1 000～1∶256 000后分别检测其A450值， 结果3.13 μg/L～200 μg/L 时线性较好， 以这段结果绘制标准曲线（图3）， 回归方程为y=0.0064x+0.0959， R2＝0.9944。抗原稀释到1∶128 000时已经检测不出， 因此， 此方法最低检出限为3.13 μg/L。

　　图3 双抗夹心ELISA法检测B7H4工作曲线（略）

　　根据以上结果， 我们确定了双抗夹心ELISA方法的最适工作条件为: 用1∶2 000 mAb包被， 100 mL/L FCS做为封闭液， 以（3.13～200.00）μg/L重组小鼠B7H4做为标准品， 1∶1 000稀释的兔抗鼠B7H4抗体作为夹心抗体， 酶标抗体浓度为1∶5 000。

　　2.3 重复性试验 批内重复试验性和批间试验的变异系数分别为7.92%和11.1%， 说明该方法重复性和稳定性都较好。

　　2.4 初步应用 采用本方法对50例健康体检者和37例术后乳腺癌患者血清样本进行检测， 结果见图4， 正常人血清B7H4含量为（31.62±9.85）μg/L， 术后乳腺癌患者血清B7H4含量为（42.52±16.63）μg/L， 两者比较差异有统计学意义（P&<0.001）。

　　图4 正常人和术后乳腺癌患者外周血中可溶性B7H4的含量（略）

　　3 讨论
　　
　　B7H4是最近发现的一个B7家族共抑制分子， 能传递负相调节信号抑制TCR介导的CD4+和CD8+T细胞的增殖、 G0/G1期的细胞周期进程和IL2的产生［3］。B7H4 mRNA在很多人类组织中， 如胎盘、 肾、 肝、 肺、 子宫、 睾丸、 脾脏等， 都有表达， 但其蛋白质在人正常组织上没有检测到［1， 9-11］， 最近发现B7H4在很多肿瘤组织中有表达， 如卵巢癌、 肾细胞癌、 小细胞肺癌、 乳腺癌［1， 3-7］。已有报道B7H4与肿瘤的发生发展和预后有关， 如肾细胞癌中B7H4阳性肿瘤患者和B7H4阴性肿瘤患者3年生存率分别为71.2%和90.5%， 而且B7H4的表达与其肿瘤的分级分期有相关［7］， 因此建立一个快速简便的检测方法可为B7H4的基础和临床应用研究都提供有力的手段。
　　
　　本实验以抗人B7H4同mAb作为包被抗体， 以兔抗小鼠B7H4多抗作为夹心抗体， 建立了定量检测B7H4的夹心ELISA方法， 结果批内和批间CV值是分别为7.92%和11.1%， 说明实验的重复性和稳定性均较好。由于人与小鼠B7H4蛋白有87%的同源性， 具有广泛的共同抗原。我们利用免疫组化法， 采用抗小鼠B7H4多克隆抗体和抗人B7H4 mAb分别对肺癌患者癌组织中B7H4的表达进行检测， 发现两者都能与人B7H4结合， 因此， 本实验采用兔抗小鼠B7H4多抗检测人的B7H4。在建立该方法的过程中， 最初我们采用兔抗小鼠B7H4多抗包被， 以mAb为夹心抗体， HRP标记羊抗鼠IgG为二抗， 结果本底偏高， 可能是包被的兔抗小鼠B7H4多抗与标记抗体之间有非特异性反应， 选择抗人B7H4 mAb包被后， 阴性对照的A450降至0.02以下， 有效地降低了本底。
　　
　　我们用上述方法对正常人和术后乳腺癌患者血清中B7H4的含量进行了检测， 发现术后乳腺癌患者血清中B7H4的含量显著高于正常人， 提示B7H4与乳腺癌的发病有一定关系， 可能是肿瘤细胞逃逸机体免疫攻击的重要方式。有关可溶性B7H4的检测在恶性肿瘤的辅助诊断、 疗效观察中的意义有待进一步研究。该方法的建立为进一步研究B7H4在肿瘤的发生发展中的作用奠定了基础。

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