RKIP介导的ERK通路在电磁辐射致海马神经元损伤中的作用

【摘要】 目的: 研究电磁辐射对原代培养海马神经元Raf激酶抑制蛋白(RKIP)和磷酸化ERK表达的影响， 应用MEK的抑制剂U0126探讨RKIP介导的ERK通路在辐射损伤中的作用。方法: 体外培养原代海马神经元， 采用XHPM、 SHPM及EMP作为辐射源， 分别建立3种电磁辐射细胞模型。通过免疫荧光标记、 激光扫描共聚焦显微镜检测RKIP和磷酸化ERK的表达; 利用Annexin VPI双标记、 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡与坏死率。结果: 三种电磁辐射后海马神经元RKIP表达均减少， 磷酸化ERK表达均增加， 且胞核移位发生， 辐射组间均未见明显差异; U0126预处理组较单纯辐射组神经元的凋亡与坏死率明显降低， 但仍高于假辐射组。结论: RKIP介导的ERK通路过度激活是电磁辐射致海马神经元凋亡与坏死的重要机制之一， U0126对电磁辐射损伤具有一定防护作用。

【关键词】 电磁辐射 海马神经元 RKIP ERK 原代培养

　　Raf激酶抑制蛋白(raf kinase inhibitor protein， RKIP)作为调控多种信号转导通路的中心信号蛋白， 在细胞的生长、 分化、 增殖和凋亡中扮演重要角色， 其中RKIP介导的Raf/MEK/ERK信号通路对于肿瘤细胞的存亡至关重要。我们前期的研究发现， 电磁辐射后大鼠海马RKIP表达明显下调［1］， 但是对于RKIP在电磁辐射致海马损伤中的作用机制及其介导的ERK通路在辐射损伤中的作用尚未见报道。为此， 本研究中选用近年来应用较为广泛的X波段高功率微波(Xband high power microwave， XHPM)、 S波段高功率微波(Sband high power microwave， SHPM)及电磁脉冲(electromagnetic pulse， EMP)作为辐射源， 通过细胞培养、 免疫细胞化学染色、 激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)、 Annexin VPI双标记、 流式细胞术(FCM)及图像分析等手段， 研究电磁辐射对原代海马神经元RKIP和磷酸化ERK表达的影响， 并应用MEK的特异性抑制剂U0126探讨RKIP介导的ERK通路在辐射损伤中的作用， 为阐明电磁辐射损伤机制和揭示3种电磁辐射损伤效应的异同提供依据， 并为辐射损伤的防诊治开辟新途径。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 Wistar大鼠， 由军事医学科学院实验动物中心提供; DMEM培养基、 N2 supplement、 B27 supplement均为Invitrogen公司产品; 马血清购自Hyclone公司; 胰蛋白酶、 谷氨酰胺、 阿糖胞苷均为Amersco公司产品; 兔抗神经元特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase， NSE)、 兔抗RKIP、 FITC或Cy3标记的羊抗兔IgG抗体均为Santa Cruz公司产品; U0126购自Promega公司; Hoechest33342购自Sigma公司; Annexin V细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司; FCM为美国BD公司产品; LSCM为BioRad公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 原代海马神经元培养与鉴定 出生12 h内Wistar大鼠， 无菌分离双侧海马， 经2.5 g/L胰蛋白酶消化， 制备细胞悬液， 以5×108/L密度接种于包被多聚L赖氨酸的塑料培养皿， 培养液含850 mL/L DMEM、 100 mL/L马血清、 10 g/L谷氨酰胺、 青霉素105 U/L、 链霉素105 U/L、 10 g/L N2和20 g/L B27。于37℃、 50 mL/L CO2及饱和湿度的培养箱内培养， 至第3天加入阿糖胞苷(3 mg/L)抑制胶质细胞过度增殖， 24 h后全量换液， 以后每周半量换液2次， 培养至7～10 d用于实验。采用NSE抗体， 以免疫细胞化学ABC法染色进行神经元鉴定。

　　1.2.2 细胞分组与辐射条件 将原代海马神经元随机分为假辐射组(Control)、 EMP组、 SHPM组、 U0126＋SHPM组、 XHPM 组及U0126＋XHPM组， 分别采用HPM和EMP模拟源辐射细胞， SHPM和XHPM平均功率密度均为100 mW/cm2， EMP场强为6×104 V/m， 辐射时间均为4 min。假辐射组进行同等条件伪辐射。

　　1.2.3 U0126给予方法 参照试剂说明书， 于辐射前30 min， 向细胞培养皿中加入MEK的特异性抑制剂U0126， 其终浓度为10 μmol/L。

　　1.2.4 免疫荧光染色检测RKIP和磷酸化ERK 辐射后6 h， 以1∶1甲醇丙酮液固定细胞(4℃， 10 min); 1 g/L胰蛋白酶作用3 min; 经100 mL/L羊血清封闭15 min后， 滴加1∶100稀释的兔抗RKIP或磷酸化ERK， 4℃过夜; 滴加1∶100稀释的FITC或Cy3标记的羊抗兔IgG，室温孵育1 h; 滴加1∶1000稀释的Hoechest染液， 避光反应10 min; 上述各步骤之间均以PBS漂洗5 min×3次。以1∶1甘油PBS封片后， 应用LSCM上机观察， 并采集图像。以PBS分别代替一抗和二抗作为阴性对照， 并以PBS同时代替一抗和二抗设立自发荧光对照， 其余步骤同上。利用ImagePro 5.0软件对荧光图像进行定量分析， 每组选取20个细胞。阳性结果FITC标记呈绿色， Cy3标记呈红色， 胞核呈蓝色。

　　1.2.5 FCM检测细胞凋亡与坏死 参照Annexin V细胞凋亡检测试剂盒操作说明。辐射后6 h， 以2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞， PBS离心洗涤， 调整细胞浓度为1×109个/L; 取1 mL细胞悬液离心收集细胞， 并将其悬浮于200 μL结合缓冲液， 加入10 μL Annexin VFITC和5 μL PI， 室温避光静置15 min; 加入300 μL结合缓冲液后应用流式细胞仪检测细胞凋亡与坏死率。以每个35 mm塑料培养皿的细胞作为一个样品， 每组测定6个样品。Annexin V与PI均阴性为正常存活细胞， Annexin V阳性(胞膜绿染)而PI阴性为凋亡细胞， PI阳性(胞核红染)为坏死细胞。

　　1.2.6 统计学分析 实验数据以x±s表示， 采用SPSS11.0统计学软件进行OneWay ANOVA方差分析和LSD、 Dunnett t检验。

　　2 结果

　　2.1 海马神经元形态学改变 倒置相差显微镜下观察， 刚分离的海马神经元小而圆， 胞体透亮;接种24 h后细胞贴壁良好， 生长旺盛， 并形成1～2个细小突起; 培养3 d后， 细胞突起明显增多、 延长， 并开始相互连接， 胞体渐丰满; 培养至7～10 d， 胞体丰满， 以锥体形居多， 间或圆形， 有折光性， 胞突细长丰富， 交织成网(图1A)。神经元鉴定结果均为阳性(图1B)。
　　
　　辐射后6 h， 各辐射组海马神经元均见胞体变圆， 折光性明显增强， 胞质空泡堆积， 或胞核结构模糊甚至消失， 胞突回缩， 可见较多死亡细胞漂浮， 辐射组间未见明显差别; U0126预处理组海马神经元生长状况明显好于单纯辐射组， 但较假辐射组略差， 可见少量死亡细胞漂浮。

　　2.2 海马神经元RKIP表达的变化 RKIP于假辐射组海马神经元胞核周围的胞质中， 呈点状聚集性分布， 但于各辐射组中其表达分布明显减少(图2)。定量分析结果显示， 各辐射组RKIP的荧光强度值分别为EMP组36.91±5.71、 SHPM组34.57±1.75、 XHPM组41.82±4.00， 均较假辐射组(67.85±9.64)明显减少(P&<0.01)， 辐射组间均未见统计学差异。

　　2.3 海马神经元磷酸化ERK表达的变化 假辐射组海马神经元磷酸化ERK均匀分布于胞质中， 呈弱阳性表达， 而各辐射组均呈强阳性表达， 且细胞核移位发生， 可见磷酸化ERK同时表达于胞质与胞核(图3)。定量分析结果表明， 各辐射组RKIP的荧光强度均较假辐射组明显增强(P&<0.01)， 其荧光强度值分别为假辐射组26.59±3.05， EMP组51.84±6.50、 SHPM组43.40±3.64、 XHPM组46.60±3.96， 辐射组间均未见统计学差异。

　　2.4 神经元凋亡与坏死率的变化 辐射后6 h， SHPM组（凋亡25.76±3.48%， 坏死56.17±4.08%）和XHPM组（凋亡26.32±3.75%， 坏死58.72±4.38%）神经元的凋亡与坏死率均较假辐射组（凋亡14.31±2.43%， 坏死29.65±3.19%）明显升高(P&<0.01)， 其中坏死增加尤为显著(P&<0.01)。U0126预处理组（USHPM组凋亡18.45±2.61%， 坏死39.47±3.49%， UXHPM组凋亡21.20±3.02%， 坏死41.51±3.57%）的细胞凋亡与坏死率均较单纯辐射组明显降低(P&<0.05或P&<0.01)， 但仍高于假辐射组(P&<0.05)， 两辐射组和两预处理组间均未见统计学差异。

　　图1 海马神经元形态学改变（略）

　　Fig 1 Morphological changes of hippocampus neurons (×400)

　　A: Primary hippocampus neurons cultured for 10 days; B: Expression of NSE in primary hippocampus neurons cultured for 10 days.

　　图2 三种电磁辐射后原代海马神经元RKIP的表达（略）

　　Fig 2 Expression of RKIP in primary hippocampus neurons after three kinds of electromagnetic radiation (IF， ×1000)

　　A: Control; B: EMP; C: SHPM; D: XHPM.

　　图3 三种电磁辐射后原代海马神经元磷酸化ERK的表达（略）

　　Fig 3 Expression of phosphorylated ERK in primary hippocampus neurons after three kinds of electromagnetic radiation (×1000)

　　A: Control; B: EMP; C: SHPM; D: XHPM.

　　3 讨论
　　
　　RKIP进化上高度保守， 在哺乳动物的脑、 心、 肝、 肺及睾丸组织中含量丰富， 参与质膜生物合成、 神经发育、 精子发生、 细胞凋亡等生理病理过程。RKIP通过与Raf1结合， 破坏Raf1与MEK的相互作用， 从而抑制ERK信号通路过度活化［2］。大量研究证实， ERK信号通路对于肿瘤细胞的存亡至关重要， 但对于ERK通路在电磁辐射损伤中的作用尚不明确。本实验我们发现， 3种电磁辐射后海马神经元RKIP表达均减少， 而磷酸化ERK表达均增加， 表明辐射后RKIP表达减少使其对Raf/MEK/ERK通路的抑制作用减弱， 导致ERK通路过度激活， 提示RKIP参与了电磁辐射所致海马神经元损伤， RKIP对ERK通路的调控可能在辐射致海马损伤中发挥重要作用， 这与我们前期的整体动物实验结果一致。
　　
　　研究表明， NGF诱导分化PC12细胞依赖ERK的长程激活(1.5～3 h); EGF促进PC12细胞增殖需要ERK的瞬时激活(&<1 h); 导致神经元死亡的ERK活化时间则至少需要24 h［3， 4］。活化的ERK的不同亚细胞定位将活化其下游的不同底物， 这些底物控制了细胞反应的类型， ERK的底物主要包括蛋白激酶、 细胞膜和胞质底物以及核底物。本实验我们发现， 辐射后6 h ERK仍过度激活， 且活化的ERK同时表达于胞质和胞核， 表明活化的ERK分别通过与胞质和胞核底物结合， 调控基因表达， 引起神经元死亡可能是辐射致海马损伤的重要机制。
　　
　　通常认为， ERK属于促细胞存活类因子， 它在生长因子的作用下活化并调节增殖、 分化、 长时程记忆和突触可塑性［5］。然而， 新近的研究表明， ERK可能作为促凋亡因子发挥作用， 如在钾离子外流诱导下， ERK发挥促神经元凋亡的作用［6］; ERK通路激活是阿尔茨海默者的早期特征之一， ERK可能参与神经元退行性变［7］; PD98059通过抑制ERK的活化， 减少细胞死亡， 并减轻神经损害 ［8］; 在B细胞和U937细胞中ERK均参与诱导细胞凋亡［9］。上述结果提示， 特定条件下， ERK可能具有促神经元凋亡与坏死的作用， 其详细机制尚需深入研究。
　　
　　U0126通过与MEK非竞争结合， 抑制其活化酶的催化活力， 从而阻制ERK的磷酸化。本研究我们发现， U0126可减少辐射所致海马神经元的凋亡与坏死， 表明U0126对于辐射所致海马神经元损伤具有一定保护作用， ERK过度活化在辐射损伤中扮演重要角色。杨树森等［10］研究发现， 采用65 mW/cm2电磁波辐射大鼠可同时激活海马ERK1/2和JNK通路， 同等条件辐射PC12细胞则导致ERK、 JNK和p38MAPK通路均激活。结合本实验结果， 我们认为， 电磁辐射所致海马神经元的凋亡与坏死可能是细胞内多条信号通路差别激活共同作用的结果， 其中ERK通路起重要调节作用。
　　
　　此外， 对于辐射后海马神经元RKIP、 磷酸化ERK的表达以及细胞的凋亡与坏死率， 辐射组间均未见统计学差异， 提示XHPM、 SHPM和EMP辐射对海马神经元的损伤机制具有相似性， 为针对不同频段电磁辐射采取通用的防诊治措施提供了实验依据。
　　
　　综上所述， RKIP介导的ERK通路过度激活对于电磁辐射所致海马神经元凋亡与坏死具有重要调节作用， ERK长程活化诱导的神经元凋亡与坏死是电磁辐射致海马损伤机制之一， 有关RKIP对ERK的调控作用仍待进一步研究。

参考文献

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