重组大鼠41BBL对树突状细胞免疫学功能的影响

【摘要】 目的: 探讨大鼠41BBL对骨髓来源的树突状细胞（DC）表面分子及免疫功能的影响。方法: 构建真核表达质粒pIRES2EGFP41BBL并利用脂质体介导转染HepG2细胞， G418筛选出阳性克隆， RTPCR和荧光显微镜分别检测41BBL基因转录和EGFP的表达; 流式细胞术（FCM）检测不同HepG2细胞与DC共培养2 d后表面CD80及MHCⅡ的表达， ELISA测定共培养上清中IL6和IL12的含量。结果: 成功构建pIRES2EGFP41BBL重组表达载体并在HepG2细胞中获得稳定表达， 重组大鼠41BBL能促进骨髓来源DC表面MHCⅡ、 CD80分子表达和分泌IL6、 IL12（P&<0.05）。结论: 重组大鼠41BBL具有促进骨髓来源DC成熟的功能。

【关键词】 大鼠41BBL 树突状细胞 免疫功能

　　41BBL（CD137L） 为肿瘤坏死因子超家族中的成员， 在免疫系统中与41BB结合提供共刺激信号增强机体的免疫反应， 有望在感染性疾病、 肿瘤、 自身免疫性疾病等中发挥重要作用［1， 2］。最近体内外实验表明41BBL和41BB存在双向信号， 而且在人和小鼠不同细胞表现出相反的生物学功能［3］。人的41BBL基因尽管成功克隆了十多年， 但作为共刺激分子不能类似于其他抑癌基因等通过免疫缺陷动物进行体内实验， 而以大鼠制作的各种人类疾病模型非常成功， 尤其是各种肿瘤和移植模型。我们利用先前克隆的大鼠41BBL构建了重组质粒pIRES2EGFP41BBL， 并转染HepG2细胞获得稳定表达， 对重组大鼠41BBL影响树突状细胞免疫学特性进行了初步研究， 为进一步研究41BBL的生物学功能提供实验基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 SD大鼠(雌雄不拘， 体质量180～200 g， 10只)购于苏州大学医学院动物中心; pIRES2EGFP质粒由苏州大学第一医院传染科黄小平医生惠赠; pMDT1841BBL质粒由苏州大学生物技术研究所保存; T4 DNA连接酶、 限制性内切酶NheⅠ、 EcoRⅠ电泳上样缓冲液、 Taq、 pfu DNA多聚酶、 逆转录酶均购自大连TaKaRa 公司; 引物由上海生工生物工程公司合成; 重组基因由上海英骏公司测序; rrIL4 、 rrGMCSF、 PE标记的小鼠 CD80 mAb及 FITC标记的小鼠MHCⅡmAb均为美 国 Protech公司产品， 灭活新生小牛血清（FCS）、 DMEM 及RPMI1640培养基均为Gibco公司产品; IL6、 IL12 ELISA试剂盒由上海森雄公司提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 pIRES2EGFP41BBL的构建和鉴定 以pMDT1841BBL质粒为模版进行PCR， 产物胶回收后和真核表达质粒pIRES2EGFP分别用NheⅠ和EcoRⅠ双酶切于37℃反应4 h， 电泳后胶回收。用T4 DNA连接酶于4℃过夜。随后以连接产物转化大肠杆菌 TOP10， 37℃ 16 h挑选阳性克隆， 增菌并提取重组质粒， 再以PCR、 双酶切鉴定， 最后重组大肠杆菌送上海英骏公司测序。

　　1.2.2 HepG2细胞的转染和稳定筛选 HepG2细胞转染按Lipofectamine2000说明书操作， 分成3组， 第 l组加入 pIRES2EGFP41BBL重组质粒， 第2组pIRES2EGFP空质粒， 第 3组为脂质体对照组， 转染细胞经G418筛选2月， 荧光显微镜观察EGFP的表达并收集细胞RTPCR检测。

　　1.2.3 大鼠DC细胞的分离培养 取健康SD大鼠， 断颈处死， 浸入750 mL/L乙醇中 5～10 min， 无菌手术取出股骨和胫骨， 尽量剥去肌肉组织， 用 PBS洗涤 3次， 剪去骨两端， 洗涤 2次， 用灭菌注射器抽取5 mL PBS， 将针头从两端插入骨髓腔， 反复冲洗出骨髓直至骨变白， 收入离心管中， 3 000 r/min离心20 min， 弃上清， 沉淀细胞用 PBS重悬， 混匀， 缓慢加至已有淋巴细胞分离液的离心管内， 形成界面， 取界面细胞至离心管内， 加PBS， 1 500 r/min离心5 min， 弃上清; 重复上述过程2次; 加培养液， 混匀， 显微镜下细胞计数， 调整细胞密度至2×109/L ; 接种细胞于24孔培养板中， 加入细胞因子Rat IL4（8 μg /L）、 Rat GMCSF（8 μg /L）， 培养箱中培养; 每天观察细胞形态变化并在第 3天半量换液， 并加入细胞因子继续培养， 于第5天吸取悬浮细胞和半贴壁细胞备用。

　　1.2.4 DC共培养 DC共培养分成 5组， 每组设3个复孔， 第1组为HepG2细胞对照， 第2组为DC阴性对照， 第 3组为LPS（脂多糖）， 第 4组空载体对照， 第 5组为重组41BBL HepG2细胞， 第1组、 第 4组和第 5组的HepG2细胞经80 mg/L丝裂霉素处理1 h后作为刺激细胞， 密度为2×105/孔， 第2组和第4组不加刺激细胞， 第 4组加入1.0 mg/L的LPS， 除第1组外其余各组均加入DC作为反应细胞， 密度为4×105/孔， 共培养在24孔板， 100 mL/L FCS、 37℃、 50 mL/L CO2条件下共同孵育48 h后收集细胞和培养上清备用。

　　1.2.5 DC细胞FCM表型和培养上清ELISA检测 细胞经PBS洗涤2次， 分别加入PE抗 CD80 mAb、 FITC抗MHCⅡ mAb， 置37℃ 30 min， 用 PBS洗2次后用细胞对照调零进行检测; 培养上清按ELISA说明书分别检测IL6、 IL12。

　　1.2.6 统计学处理 数据均以x±s表示， 多组间比较采用随机分组单因素方差分析， 两组间比较采用t检验， P&<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 重组质粒pIRES2EGFP41BBL鉴定 pIRES2EGFP41BBL经PCR和NheⅠ/EcoRⅠ酶切均获得1条约930 bp的电泳条带， 其大小与41BBL 全长cDNA 相符， PCR和酶切鉴定结果见图1; 测序结果表明质粒41BBL基因同先前报道并登录在GenBank上的完全一致。

　　2.2 重组41BBL基因HepG2细胞的鉴定 pIRES2EGFP41BBL重组质粒和pIRES2EGFP空质粒转染HepG2细胞， 在含800 mg/L G418的100 mL/L小牛血清DMEM培养液中筛选2月后， 得到稳定转染细胞并作RTPCR， 扩增产物在10 g/L 琼脂糖凝胶中电泳， 紫外灯下观察到1条约930 bp 的特异性条带， 而空载体转染细胞组及未转染细胞组均无特异性条带， 表明41BBL mRNA已经在HepG2细胞中转录（图2）。为进一步证明41BBL在HepG2细胞中的表达， 利用pIRES2EGFP质粒有绿荧光蛋白表达的特性， 在荧光显微镜下观察转染细胞， pIRES2EGFP41BBL重组质粒和pIRES2EGFP空质粒转染HepG2细胞均有绿荧光（图3）。

　　图1 pIRES2EGFP41BBL质粒的PCR和酶切鉴定（略）

　　Fig 1 Restrictive enzyme digestion analysis and PCR identification of recombinant vector pIRES2EGFP41BBL

　　1: PCR product of rat 41BBL gene; 2: pIRES2EGFP41BBL/Nhe Ⅰ+EcoR Ⅰ; M: DNA marker.

　　图2 RTPCR检测不同HepG2细胞大鼠41BBL表达（略）

　　Fig 2 Detection for expression of 41BBL in HepG2 cells by RTPCR

　　M: DNA marker; 1: RTPCR of HepG2 cells; 2: RTPCR of pIRES2EGFPHepG2 cells; 3: RTPCR of pIRES2EGFP41BBLHepG2 cells.

　　2.3 大鼠骨髓DC的形态观察 由大鼠骨髓分离的骨髓细胞于培养的第2天出现部分贴壁， 细胞伸出伪足状突起， 第5天出现成簇状椭圆形细胞从贴壁细胞中突出并见部分细胞形成毛刺状突起（图4）， 共培养48 h后pIRES2EGFP41BBL重组细胞组和LPS组上层悬浮细胞突起明显， 毛刺状更多， 贴壁生长细胞呈集落状。

　　2.4 混合培养后DC表面分子MHCⅡ和CD80的表达 DC混合培养48 h后吸出悬浮细胞和半悬浮细胞， 洗涤后用FITCMHCⅡmAb、 PE CD80 mAb染色， FCM检测各组细胞表面分子表达。第1组MHCⅡ和CD80表达率分别为27.3%和25.2%， 第2组为57.3%和29.1%， 第3组为70.9%和73.5%， 第4组为59.4%和42.3%， 第5组为67.7%和52.6%。

　　2.5 混合培养上清中IL6和IL12的检测 DC混合培养48 h 后的上清用ELISA检测IL6和IL12的水平， 结果见表1。

　　图3 重组HepG2细胞的绿荧光观察（略）

　　Fig 3 Observation of recombinant HepG2 under fluorescence microscope (×200)

　　A: pIRES2EGFPHepG2; B: pIRES2EGFP41BBLHepG2.

　　图4 DC形态学观察（略）

　　Fig 4 Observation of DC morphology under microscope (×400)

　　A: Cultured for 2 days; B: Cultured for 5 days.

　　表1 ELISA检测DC培养上清中IL6和IL12的浓度（略）

　　Tab 1 Concentration of IL6 and IL12 in DC culture detected by ELISA

　　aP&<0.05 vs pIRES2EGFPHepG2 or DC control， cP&<0.05 vs all others.

　　3 讨论
　　
　　大鼠 41BBL基因定位于大鼠染色体 9q1， 编码区全长为927 bp， 其蛋白质由308个氨基酸分子组成， 相对分子质量（Mr）为 33 469， 与小鼠、 人在氨基酸水平的同源性分别为 83%、 31%［4］。对大鼠 41BBL的功能研究尚未见报道， 故本课题利用双表达载体pIRES2EGFP与大鼠41BBL全长基因进行连接， 构建重组表达载体pIRES2EGFP41BBL， 该重组载体在转录时目的基因在前EGFP在后形成一条RNA， 而在表达时由于载体本身设计不同的调控序列， 理论上目的基因表达比EGFP高10倍， 所以通过RTPCR测定mRNA转录以及荧光显微镜观察EGFP间接证明了41BBL的表达。
　　
　　Futagawa等［5］利用重组小鼠41BBL基因P815细胞与骨髓来源DC共培养， 发现能上调共刺激分子CD80和CD86的表达并促进DC分泌IL6和IL12， Laderach等［6］发现人的41BBL对DC也具相似的作用。最近利用41BBL与急性粒细胞白血病细胞来源的DC（AMLDC）共培养， 发现41BBL能明显促进AMLDC的成熟［7］。本课题利用重组大鼠41BBL基因HepG2细胞与大鼠DC共培养48 h后， 对DC表面分子MHCⅡ和CD80进行检测， 发现重组41BBL基因细胞具有一定的上调作用， 由于HepG2细胞作为刺激细胞在FCM检测时可能对结果具有干扰作用， 我们设立了HepG2细胞对照排除可能存在的干扰， 结果表明HepG2细胞有一定的非特异染色， 但荧光强度比较低。Bukczynski等［8］利用人41BBL基因转染外周血来源DC， 发现41BBL转染能明显上调共刺激分子CD80和CD86的表达以及分泌细胞因子IL6和IL12， 进一步对41BBL基因重组DC对流感病毒和EB病毒抗原提呈研究， 发现重组41BBL基因DC对抗原的敏感性明显提高， 41BBL基因转染也明显高于CD80或CD86基因。41BBL基因转染不同时期的HIV患者的外周血来源DC， 同样具有免疫增强作用［9］。本课题对大鼠41BBL基因转染DC也进行了研究， 得到类似结果。同时设立DC对照组和经典刺激DC成熟的LPS组， MHCⅡ和CD80的表达效率分别达到57.3%和29.1%、 70.9%和73.5 %。Langstein等［10］发现41BBL对单核细胞的活化作用大于MCSF和GMCSF而小于LPS的作用， 我们的实验结果表明重组大鼠41BBL对DC也具有一定的促成熟作用， 但也低于LPS。对大鼠DC共培养上清中IL6和IL12的检测也得到类似结果， 表明41BBL具有促进DC成熟细胞因子分泌的作用， 但这种作用相对较弱， 可能原因是HepG2细胞本身分泌了一些人的抑制细胞因子， 对大鼠DC分泌作用具有一定的干扰作用。
　　
　　综上所述， LPS有非常强的刺激DC成熟的作用， 但由于只能在体外实验中应用， 所以找寻一种具有较强作用， 又能在体内应用的刺激物就非常重要， 而41BBL可能是比较理想的刺激物， 有望在将来成为提高免疫反应的理想分子。大鼠和人的41BBL具有相似的免疫学功能， 大鼠又作为研究许多人类疾病的模型， 有许多不可比拟的优点。共刺激分子41BBL的许多功能实验研究必须在体内完成， 因此， 对大鼠41BBL的体内外实验研究能进一步认识41BBL的功能， 值得进一步深入探讨。

参考文献

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　　［8］ Bukczynski J， Wen T， Wang C， et al. Enhancement of HIVspecific CD8 T cell responses by dual costimulation with CD80 and CD137L［J］. J Immunol， 2005， 175(10): 6378-6389.

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　　［10］ Langstein J， Becke FM， Soellner L， et al. Comparative analysis of CD137 and LPS effects on monocyte activation， survival， and proliferation［J］. Bio Chem Biophys Res， 2000， 273: 117-122.